胡志和，王星璇，王麗娟，吳子健，薛 璐

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

食物過敏是機體免疫系統(tǒng)對機體攝入的食物產(chǎn)生的、由免疫介導的不良反應，又稱為食物超敏反應[1]。多數(shù)食物過敏是由免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導的I型過敏反應，主要包括致敏階段和效應階段。

致敏階段即機體初次攝入食物后，過敏原穿過腸黏膜，被腸黏膜抗原遞呈細胞（antigen-presenting cell，APC）捕獲，通過受體介導的吞噬作用進入APC細胞中，與APC中的泛素共價連接而被激活，這些泛素化的過敏原移至蛋白體復合物并被降解為多肽片段。含有抗原決定簇的已降解的多肽片段與主要組織相容性復合物II（major histocompatibility complex II，MHC-II）類分子結(jié)合，然后表達于細胞表面被未經(jīng)修飾的CD4＋T細胞識別[2]，有效地激活幼稚CD4＋T細胞增殖分化成輔助性T（helper T，Th）細胞亞群，Th細胞可分成Th1或Th2兩大類[3]。Th1細胞主要介導機體細胞免疫應答，在抗感染、急性排斥反應、器官移植排斥反應和自身免疫病的誘導過程中起重要作用[4-6]。Th2細胞主要介導機體體液免疫應答，輔助抗體生成，在過敏反應中起主導作用，使抗原特異B細胞分泌IgG和IgE抗體[4-6]。Th2細胞分泌的白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子誘導B細胞類別轉(zhuǎn)換以及分泌過敏原特異性IgE，特異性IgE可與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面高親和力受體FcεRI結(jié)合，成為致敏肥大細胞和嗜堿性粒細胞，致使機體處于致敏狀態(tài)。而IgE可以促進肥大細胞表面FcεRI的表達以及其他介質(zhì)的釋放[7]。同時Th1細胞分泌的IL-2、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）也可以促進B細胞增殖分化。IL-3和IL-4可以協(xié)同刺激肥大細胞的增殖。

過敏反應的效應階段即機體再次接觸過敏原時，B細胞迅速分泌大量的特異性IgE抗體并擴散至全身，F(xiàn)cεRI與IgE-過敏原復合物相交聯(lián)，引發(fā)肥大細胞、嗜堿性粒細胞活化脫顆粒，釋放出組胺（histamine，HIS）、白三烯、5-羥色胺等活性物質(zhì)，使機體的平滑肌收縮、毛細血管擴張、血管通透性增強，導致機體的組織液滲出，引起水腫，作用于皮膚、腸道、呼吸道甚至全身，從而引起蕁麻疹、過敏性胃腸炎、哮喘、變應性鼻炎、過敏性休克等一系列癥狀[8]。

蝦制品主要包括蝦仁[9-10]、蝦肉及其制品[11-12]、蝦蛋白[13-14]等，除了加工研究外，對海蝦過敏原及其致敏性研究[15-18]較多，但對其致敏性消減前后相關(guān)細胞因子的變化研究較少。Schiavi等[19]用蝦原肌球蛋白建立過敏小鼠動物模型，研究了8 種腸道益生菌對小鼠過敏反應的影響。結(jié)果顯示，益生菌處理組血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-10和IFN-γ質(zhì)量濃度相比對照組增加，IgE含量，IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子質(zhì)量濃度，HIS質(zhì)量濃度，過敏反應評分相比對照組有所降低。因此，益生菌處理可以緩解小鼠過敏反應，使得小鼠體內(nèi)的免疫應答由Th細胞向Th2細胞偏移并逐漸恢復平衡狀態(tài)。

本研究采用超高壓酶法消減致敏性，以致敏性消減程度不同的南美白對蝦的蝦仁、蝦肉和蝦蛋白為原料，以豚鼠為受試動物，建立食物過敏模型。檢測過敏豚鼠血清中IgE、HIS和相關(guān)細胞因子（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））的變化情況，觀察細胞因子與食物過敏的相關(guān)性，并推斷食物過敏對Th細胞平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

英國種Hartly豚鼠（體質(zhì)量為220～240 g）購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。

南美白對蝦 天津市韓家墅水產(chǎn)批發(fā)市場；海蝦過敏豚鼠血清 天津商業(yè)大學食品毒理實驗室制備；胰蛋白酶、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、吐溫20、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗豚鼠IgG抗體 美國Sigma公司；丙酮（分析純）天津市凱通化學試劑有限公司；氯化鉀（分析純）、鹽酸（分析純）、雙氧水（體積分數(shù)30%） 天津市贏達稀貴化學試劑廠；鄰苯二胺（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；豚鼠IgE、HIS、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 北京博奧拓達科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽、Scientz-50N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；HPPL2-800/2.5型超高壓設(shè)備 華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；L535-1型低速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；SpectraMax 190型酶標分析儀 深圳市山特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓結(jié)合酶法制備低致敏性蝦制品

根據(jù)文獻[20]確定的高壓結(jié)合酶法消減蝦仁致敏性的條件，制備低致敏性蝦制品，方法略有改變。

低致敏性蝦蛋白的制備：將新鮮的南美白對蝦與生理鹽水1∶1（m/V）混合勻漿，預冷5 min后加入冷丙酮（－20 ℃預冷過夜）脫脂肪，低溫離心后收集沉淀物移至干凈濾紙上，分散自然風干，即為丙酮粉。將丙酮粉與1 mol/L KCl抽提液（含有5 mmol/L二硫蘇糖醇）按1∶15（m/V）的比例4 ℃條件下抽提過夜（12～17 h）后于4 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，收集上清液，沉淀物與抽提液按1∶15（m/V）比例繼續(xù)在4 ℃下靜置提取4 h，按上述條件離心后收集上清液，兩次上清液合并即為蛋白粗提取液，蛋白粗提取液經(jīng)透析后冷凍干燥獲得蝦仁蛋白。將獲得的蝦仁蛋白在冰溫下加酶溶液混勻，真空密封后在超高壓下加酶水解。

低致敏性蝦肉制備：將新鮮蝦仁用組織搗碎勻漿機處理，在冰溫下將蝦肉與酶液按比例混勻，真空密封后在高壓下加酶水解。

低致敏性蝦仁制備：將新鮮蝦仁稱質(zhì)量，按照1 孔/cm2的密度對蝦仁進行打孔，在冰溫下將蝦仁與胰蛋白酶溶液按照比例混合，真空密封后，在高壓下進行酶解。

超高壓處理條件為40 ℃、壓力200 MPa、保壓時間40 min；處理蝦蛋白時，加酶量為2 000 U/g底物、蛋白質(zhì)量分數(shù)為3%；處理蝦肉時，加酶量為3 000 U/g蝦肉、蝦肉與酶溶液質(zhì)量比為150∶100；處理蝦仁時，加酶量為3 000 U/g蝦仁、蝦仁與酶溶液的質(zhì)量比為150∶100。經(jīng)超高壓下酶解處理的蝦肉和蝦仁，分別制備丙酮粉，提取蝦蛋白。用ELISA法檢測其致敏性，對照組為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），各組均在492 nm波長處測定OD值，根據(jù)下式計算致敏性的消減率。

1.3.2 過敏豚鼠血清的制備

參考文獻[21]的方法，將英國種Hartly豚鼠隨機分為7 組，每組8 只，雌雄各半。其中包括陰性對照組（pH 7.5 PBS）、陽性對照組（未處理蝦蛋白）、實驗組（經(jīng)處理的3 種樣品，即消減致敏性的蝦蛋白、消減致敏性后蝦肉和蝦仁的提取蛋白）；另外，設(shè)置兩組只致敏不激發(fā)的實驗組（一組是PBS致敏不激發(fā)；另一組為未處理蝦蛋白致敏不激發(fā)），直接取血清備用。

將以上7 組豚鼠進行致敏處理，陰性對照組用PBS腹腔注射、陽性對照組和實驗樣品組腹腔注射未處理的蝦蛋白溶液（pH 7.5的PBS溶解，蛋白質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL）進行致敏。腹腔注射用量均為每只每次1.0 mL，隔日注射1 次，共計3 次。在致敏期間，每天兩次觀察記錄豚鼠的反應，其中包括一般狀態(tài)、進食、排泄物、有無過敏反應表現(xiàn)等。

在末次致敏后第10天將實驗組豚鼠進行激發(fā)（不包括只致敏不激發(fā)的實驗組）。陰性對照組靜脈注射PBS，陽性對照組注射未處理的蝦蛋白，樣品組注射高壓結(jié)合酶處理后樣品（處理的蝦蛋白和處理后蝦肉、蝦仁提取的蛋白均用PBS溶解，質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL）。靜脈注射用量均為每只每次2.0 mL。激發(fā)后立即觀察豚鼠在60 min內(nèi)的反應。然后，將包括只致敏不激發(fā)實驗組在內(nèi)的豚鼠，分別頸動脈取血，靜置10～20 min后離心收集血清，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 豚鼠血清中IgE的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上120、60、30、15、7.5 U/mL，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記120 U/mL的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。

加樣：將試劑盒在室溫下平衡0.5 h再加樣。空白孔用于調(diào)零不加樣（只加顯色劑A、B和終止液）；標準品孔每孔加入稀釋好的標準品50 μL，零孔加入標準品稀釋液50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL（零孔作為標準曲線的最后一個點）；樣品孔加入樣品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37 ℃培養(yǎng)箱中保溫30 min。

洗滌：揭掉封板膜，棄去試劑盒各孔中的液體并甩干，然后向每孔加滿洗滌液（將25 倍濃縮洗滌液用蒸餾水25 倍稀釋），靜置30 s后棄去，如此重復5 次，拍干。

加樣：標準品孔和樣品孔中加入50 μL親和素-HRP，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37 ℃培養(yǎng)箱中保溫30 min。

洗滌：揭掉封板膜，棄去試劑盒各孔中的液體并甩干，然后向每孔加滿洗滌液（將25 倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25 倍），靜置30 s后棄去，如此重復5 次，拍干。

顯色：每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。

終止：每孔加入50 μL終止液終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

測定：加入終止液后，立即用空白孔調(diào)零，依序測量各孔的光密度值（OD450nm）。

計算：根據(jù)濃度和OD450nm算出標準曲線的回歸方程，使用ELISAcalc軟件進行計算，擬合模型選用Logistic曲線。

1.3.4 豚鼠血清中HIS的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記120、60、30、15、7.5 μg/mL，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記為120 μg/mL的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5 豚鼠血清中相關(guān)細胞因子檢測

1.3.5.1 IL-1的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上120、60、30、15、7.5 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記120 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.2 IL-2的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上320、160、80、40、20 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記320 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.3 IL-3的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上400、200、100、50、25 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記400 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.4 IL-4的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上160、80、40、20、10 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記160 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.5 IL-6的檢測

IL-6的檢測操作與IL-2的檢測相同。

1.3.5.6 IL-10的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上640、320、160、80、40 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記640 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.7 IFN-γ的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記上800、400、200、100、50 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記800 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.3.5.8 TNF-α的檢測

標準品的稀釋：先將標準品凍干粉用標準品稀釋液定容到150 μL，然后混勻即為標準品原液。取5 支干凈的Eppendorf管，分別標記640、320、160、80、40 ng/L，每管加150 μL的標準品稀釋液，取150 μL標準品原液加入標記640 ng/L的管中，混勻后同樣取出150 μL，加入下一管，以此類推直至最后一管。其他操作同1.3.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行顯著性分析，處理結(jié)果均以平均值±標準差表示，圖表制作利用Origin 8和Excel 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦制品致敏性引發(fā)豚鼠血清中IgE變化

用未處理蝦蛋白進行致敏，分別用未處理蝦蛋白、處理后的蝦蛋白、處理后蝦肉和蝦仁提取的蛋白激發(fā)豚鼠，然后收集各組豚鼠血清，用ELISA試劑盒測定血清中IgE的含量，血清中IgE含量的變化見圖1。

圖1 豚鼠血清中IgE的含量Fig.1 IgE levels in serum of guinea pigs

陰性對照組（組1）血清中I g E的含量為（2.639f0.154）U/mL，陽性對照組（組3）血清中IgE的含量為（9.314f0.120）U/mL。因此，蝦蛋白引起的過敏反應能夠引發(fā)IgE分泌量的增加。另外，用未處理的蝦蛋白致敏不激發(fā)（組4），豚鼠血清中IgE的含量為（4.781f0.230）U/mL，說明初次致敏也會使血液中IgE的分泌量顯著增加。

陽性對照組（組3）與樣品組（組5～7）血清中IgE的含量均有顯著性差異（P＜0.05）。高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白組（組5）與陰性對照組（組1）血清中IgE含量無顯著性差異（P＞0.05）。而高壓結(jié)合酶處理后的蝦仁組（組7）、高壓結(jié)合酶處理后的蝦肉組（組6）與陰性對照組存在顯著差異（P＜0.05）；與陽性對照未激發(fā)組（組4）IgE含量無顯著性差異（P＞0.05）。因此，高壓結(jié)合酶處理后的蝦仁、蝦肉、蝦蛋白致敏性均得到了有效改善，其中高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白致敏性消減效果要優(yōu)于蝦仁及蝦肉組。另外，比較組5～7的結(jié)果也可發(fā)現(xiàn)，處理的樣品基質(zhì)環(huán)境（溶解的蝦蛋白、蝦肉、整體蝦仁）對致敏性消減效果存在影響；處理樣品組與組4的結(jié)果相比，說明致敏性雖然不能完全消減，但能夠達到或優(yōu)于初次致敏的水平。

傅玲琳等[22]研究了乳酸菌對蝦原肌球蛋白致敏性的消減作用，檢測過敏后小鼠血清中特異性抗體IgE含量增加。Zhang Lili等[23]通過用卵清蛋白致敏的小鼠模型研究雙歧桿菌對小鼠過敏反應的抑制作用，發(fā)現(xiàn)食物過敏小鼠血清中IL-4、IgE含量增加，雙歧桿菌可以抑制過敏小鼠體內(nèi)IL-4、IgE的產(chǎn)生，并抑制小腸中Th2反應。張浩等[24]通過卵白蛋白建立致敏的小鼠模型研究食物過敏小鼠血清中特異性抗體IgE的變化，結(jié)果表明過敏小鼠血清中IgE含量明顯增加。

2.2 蝦制品的致敏性引發(fā)豚鼠血清中HIS的變化

圖2 豚鼠血清中HIS的質(zhì)量濃度Fig.2 HIS levels in serum of guinea pigs

由圖2可知，陰性對照組（組1）HIS的質(zhì)量濃度為（7.153f0.804）μg/mL，陽性對照組（組3）HIS的質(zhì)量濃度為（33.097f1.513）μg/mL。因此，蝦蛋白引發(fā)的食物過敏會導致更多的HIS釋放。另外，用未處理的蝦蛋白致敏不激發(fā)（組4），豚鼠血清中HIS質(zhì)量濃度為（18.014f1.055）μg/mL，說明初次致敏也會使得血清中HIS質(zhì)量濃度發(fā)生顯著性變化。

陽性對照組（組3）與樣品組（組5～7）血清中HIS質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05）；陰性對照組（組1）與樣品組（組5～7）血清中HIS質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05）；高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白（組5）、高壓結(jié)合酶處理后的蝦肉（組6）和蝦仁（組7）與陽性對照未激發(fā)組（組4）血清中HIS質(zhì)量濃度無顯著性差異。這表明，過敏使得HIS釋放量增加，過敏性越強，HIS的釋放量越多；高壓結(jié)合酶處理后的蝦仁及其制品的致敏性均得到了有效改善，其中高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白致敏性消減效果要優(yōu)于蝦仁及蝦肉組，該結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的趨勢一致；但ELISA檢測（處理蝦蛋白的致敏性消減率為97.04%、蝦肉的致敏性消減率為95.00%、蝦仁的致敏性消減率為94.50%）結(jié)果與體內(nèi)檢測相比，在致敏強度方面還存在差異。但處理的樣品組與組4相比，處理樣品雖然不能完全消除致敏性，但可達到初次致敏的水平。

HIS主要是由過敏反應效應階段致敏的肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌的一種化學遞質(zhì)。它在過敏反應中起到重要的作用，可使機體的平滑肌收縮、毛細血管擴張、血管通透性增強，導致機體的組織液滲出，引起水腫，作用于皮膚、腸道、呼吸道甚至全身，從而引起蕁麻疹、過敏性胃腸炎、哮喘、變應性鼻炎、過敏性休克等一系列癥狀[8]。HIS是肥大細胞脫顆粒標志物，是過敏反應中基本的病理和生理反應[25]。李潔等[26]檢測了不同季節(jié)過敏性鼻炎患者血清中HIS的含量，發(fā)現(xiàn)冬季是鼻炎的高發(fā)季，過敏性鼻炎患者血清中HIS含量升高，本研究的結(jié)果與其研究結(jié)果一致。

2.3 蝦制品的致敏性引發(fā)豚鼠血清中相關(guān)細胞因子變化

2.3.1 IL-1的變化

圖3 豚鼠血清中IL-1質(zhì)量濃度Fig.3 IL-1 levels in serum of guinea pigs

正常情況下體內(nèi)IL-1含量很少，絕大多數(shù)是外來的抗原刺激巨噬細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞等細胞合成和分泌的，主要可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用：可以與抗原協(xié)同刺激APC，增強APC遞呈抗原的能力；促進T細胞活化，促進T細胞產(chǎn)生IL-2；促進B細胞增殖分化、促進抗體的分泌；募集中性粒細胞，參與炎癥反應；還可以誘導機體產(chǎn)生IL-6[27]。

由圖3可知，陰性對照組I L-1質(zhì)量濃度為（4.074f0.383）ng/L，陽性對照組IL-1質(zhì)量濃度為（21.147f0.339）ng/L，表明過敏原可以刺激豚鼠體內(nèi)IL-1的合成與分泌。

高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白（組5）、蝦肉（組6）、蝦仁（組7）與陽性對照組（組3）血清中IL-1質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05）；其變化趨勢與3 種制品致敏性消減的趨勢（處理后蝦蛋白、蝦肉、蝦仁的致敏性消減率分別為97.04%、95.00%、94.50%）一致，致敏性消減率越高，IL-1分泌越少；同時，該結(jié)果與血清中IgE（圖1）和HIS（圖2）水平的變化趨勢相同。因此，IL-1與食物過敏具有相關(guān)性。

Park等[28]通過觀察大鼠肥大細胞脫顆粒以及測定IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的變化評價南非天竺葵（Pelargonium sidoides，PS）和黃連在體外和體內(nèi)的抗炎作用，證明了PS和黃連可以有效的抑制肥大細胞脫顆粒，并抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的分泌，其結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。

2.3.2 IL-2的變化

圖4 豚鼠血清中IL-2質(zhì)量濃度Fig.4 IL-2 levels in serum of guinea pigs

由圖4可知，陰性對照組I L-2質(zhì)量濃度為（8.829f0.564）ng/L，陽性對照組IL-2質(zhì)量濃度為（16.029f0.671）ng/L。因此，過敏原可以刺激豚鼠體內(nèi)IL-2的合成與分泌。

高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白（組5）、蝦肉（組6）、蝦仁（組7）與陽性對照組（組3）血清中IL-2質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05）；處理后的蝦蛋白（組5）、蝦肉（組6）與陰性對照組（組1）無顯著差異（P＞0.05）。因此，過敏原致敏性消減率越高，豚鼠體內(nèi)IL-2質(zhì)量濃度越低；各樣品組血清中IL-2的變化趨勢與血清中IgE（圖1）和HIS（圖2）水平的變化趨勢基本一致。因此，IL-2與食物過敏具有相關(guān)性。

IL-2主要是由活化的Th1細胞產(chǎn)生，作為Th1細胞的自分泌細胞因子，不僅可以刺激Th1細胞產(chǎn)生干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-12，增強自然殺傷（natural killer，NK）細胞、巨噬細胞的作用和細胞毒性[29-31]；還可以促進Th2細胞的活化[32]。劉志昂等[33]通過檢測過敏性鼻炎患者在治療前后血清中IL-2、IL-6水平的變化發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，過敏性鼻炎患者血清中IL-2、IL-6水平顯著升高，其結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。

2.3.3 IL-3的變化

IL-3主要是Th2細胞分泌的多效性細胞因子[34-35]，但在一定的條件下肥大細胞、嗜堿性粒細胞、肺巨噬細胞等也產(chǎn)生IL-3。IL-3主要參與T、B淋巴細胞發(fā)育，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞功能，促進IgE的合成、誘導嗜酸性粒細胞游走，在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[36-37]。

圖5 豚鼠血清中IL-3質(zhì)量濃度Fig.5 IL-3 levels in serum of guinea pigs

由圖5可知，陰性對照組（組1）IL-3質(zhì)量濃度為（36.502f0.687）ng/L，陽性對照組（組3）IL-3質(zhì)量濃度為（63.305f0.635）ng/L。陽性對照組IL-3質(zhì)量濃度與其他組（組4～7）均有顯著性差異（P＜0.05），表明過敏原可以刺激豚鼠體內(nèi)IL-3的合成與分泌；高壓結(jié)合酶處理后蝦蛋白（組5）與陰性對照組（組1）、陰性對照未激發(fā)組（組2）、陽性對照未激發(fā)組（組4）血清中IL-3質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05）；高壓結(jié)合酶處理后的蝦肉（組6）、蝦仁組（組7）血清中IL-3質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），但與陰性對照組存在顯著差異（P＜0.05）。該結(jié)果與ELISA檢測的結(jié)果雖然存在差異，但趨勢是一致的，即過敏原消減效果越好，IL-3的分泌量越少。另外，各樣品組的血清中IL-3變化趨勢與血清中IgE（圖1）和HIS（圖2）水平的變化趨勢相同。因此，IL-3與食物過敏具有相關(guān)性。

江茵等[38]在黃芪多糖對哮喘大鼠氣道炎癥及IL-3表達影響的研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組的肺組織中IL-3的表達最強，通過黃芪多糖治療后，其IL-3的表達量顯著減少，推測其是通過抑制IL-3的表達來實現(xiàn)抑制哮喘大鼠的氣道炎癥。鄧輝雨[39]在過敏性哮喘兒童血清IgE、IL-3、IL-4的影響研究中發(fā)現(xiàn)，IL-3、IL-4在支氣管哮喘患兒中的水平明顯高于對照組患者，經(jīng)布地奈德治療后，其IL-3的水平明顯降低。上述文獻的研究結(jié)果與本研究的結(jié)果一致。

2.3.4 IL-4的變化

圖6 豚鼠血清中IL-4質(zhì)量濃度Fig.6 IL-4 levels in serum of guinea pigs

由圖6可知，陰性對照組I L-4質(zhì)量濃度為（35.996f1.451）ng/L，陽性對照組IL-4質(zhì)量濃度為（64.692f2.327）ng/L，二者存在顯著差異（P＜0.05）。因此，過敏原可以刺激豚鼠體內(nèi)IL-4的合成與分泌，致敏性越高，IL-4質(zhì)量濃度增加越多。高壓結(jié)合酶處理后的蝦蛋白（組5）、蝦肉（組6）、蝦仁（組7）激發(fā)的豚鼠血清與陽性對照組血清中IL-4質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05），表明高壓結(jié)合酶處理蝦仁、蝦肉和蝦蛋白能夠較好地消減其致敏性；但3 組樣品激發(fā)的豚鼠血清中IL-4的分泌量無顯著差異，該結(jié)果與蝦致敏性消減（ELISA檢測）的結(jié)果一致。因此，IL-4與食物過敏具有相關(guān)性。

IL-4是由Th2、肥大細胞、嗜堿性粒細胞分泌的，具有多種生物學活性：如促進B細胞的增殖、分化，促進抗體的分泌；促進Th0細胞向Th2細胞分化，抑制Th1細胞活化及分泌細胞因子；協(xié)同IL-3共同刺激肥大細胞的增殖[40]。IL-4在調(diào)節(jié)體液免疫中起到關(guān)鍵的作用。IL-4誘導B細胞轉(zhuǎn)換成可以分泌IgE抗體的漿細胞和記憶B細胞，同時IL-4可以刺激MHC-II類分子的產(chǎn)生，而MHC-II類分子對T細胞識別抗原有限制作用；同時IL-4可以刺激MHC-II類分子的表達，而MHC-II類分子大多數(shù)表達于APC上，可以根據(jù)MHC-II類分子的表達評價APC抗原遞呈能力，因而MHC-II類分子對T細胞識別抗原有限制作用[41]。

傅玲琳等[22]在研究乳酸菌對蝦原肌球蛋白致敏性的消減作用時發(fā)現(xiàn)過敏小鼠體內(nèi)IL-4質(zhì)量濃度增加。Liu Mengyun等[42]通過用卵清蛋白致敏的小鼠模型，研究嬰兒雙歧桿菌CGMCC33-2對小鼠過敏反應的抑制作用，結(jié)果表明食物過敏小鼠血清中細胞因子IL-4質(zhì)量濃度增加，嬰兒雙歧桿菌CGMCC33-2可以抑制過敏小鼠體內(nèi)IL-4等細胞因子的產(chǎn)生。這些文獻的研究結(jié)果與本實驗的結(jié)果一致。

2.3.5 IL-6的變化

由圖7可知，陰性對照組（組1）IL-6質(zhì)量濃度為（35.214f0.467）ng/L，陽性對照組（組3）IL-6質(zhì)量濃度為（43.664f0.933）ng/L。陰性對照組、高壓結(jié)合酶處理后蝦蛋白（組5）、蝦肉（組6）、蝦仁組（組7）的IL-6質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），與陽性對照組血清中IL-6質(zhì)量濃度差異顯著（P＜0.05）。因此，過敏原可以刺激豚鼠體內(nèi)IL-6的合成與分泌，高壓結(jié)合酶處理后的蝦仁及其制品致敏性得到消減，該結(jié)果與蝦致敏性消減（ELISA檢測）的結(jié)果一致。因此，IL-6與食物過敏具有相關(guān)性。

圖7 豚鼠血清中IL-6質(zhì)量濃度Fig.7 IL-6 levels in serum of guinea pigs

IL-6是由T細胞、B細胞、巨噬細胞等細胞產(chǎn)生的，IL-1、TNF-a等細胞因子也可誘導正常的細胞產(chǎn)生IL-6[32]。IL-6可以刺激T細胞增殖、分化；刺激B細胞增殖、分化以及分泌抗體；參與炎癥反應，誘導急性期蛋白合成及釋放，引起機體的發(fā)熱[43]。張寧[44]用卵清蛋白建立了小鼠過敏性鼻炎模型，研究姜黃素對過敏性疾病的治療效果，發(fā)現(xiàn)與卵清蛋白組相比，姜黃素組小鼠血清中細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的釋放量明顯降低。表明姜黃素可以通過抑制與過敏反應相關(guān)的炎癥因子而發(fā)揮抗炎作用。Park等[28]通過觀察大鼠肥大細胞脫顆粒以及測定IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的變化，評價狹花天竺葵和黃蓮在體外和體內(nèi)的抗炎作用，結(jié)果表明，狹花天竺葵和黃連可以有效抑制肥大細胞脫顆粒，并抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的分泌。上述文獻報道的過敏反應中IL-6等炎癥細胞因子質(zhì)量濃度增加與本實驗的結(jié)果一致。

2.3.6 IL-10的變化

IL-10是一種重要的抗炎和免疫調(diào)節(jié)因子[45]，可由CD4＋T、CD8＋T、Th1、Th2、B細胞、樹突狀細胞、NK細胞、肥大細胞、中性粒細胞等分泌產(chǎn)生[46]。IL-10在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，通過降低樹突狀細胞、巨噬細胞表面MHC-II類分子的表達，削弱抗原提呈細胞的功能，抑制T細胞的增殖等多種途徑，有效抑制細胞介導的免疫反應[47]。

圖8 豚鼠血清中IL-10質(zhì)量濃度Fig.8 IL-10 levels in serum of guinea pigs

由圖8可知，陰性對照組I L-1 0質(zhì)量濃度為（258.681f1.841）ng/L，陽性對照組IL-10質(zhì)量濃度為（209.072f2.175）ng/L，兩組存在顯著性差異（P＜0.05）。陰性對照組（組1）、陰性對照未激發(fā)組（組2）、陽性對照未激發(fā)組（組4）、高壓結(jié)合酶處理后蝦蛋白組（組5）IL-10質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），高壓結(jié)合酶處理后的蝦肉（組6）及蝦仁（組7）與陽性對照組血清中IL-10無顯著性差異（P＞0.05），該結(jié)果表明過敏原可抑制豚鼠體內(nèi)IL-10的合成與分泌。因此，IL-10與食物過敏具有相關(guān)性。

Zhang Lili等[23]通過用卵清蛋白致敏的小鼠模型研究雙歧桿菌對小鼠過敏反應的抑制作用，結(jié)果表明食物過敏小鼠血清中IL-4、IgE質(zhì)量濃度增加，雙歧桿菌可以抑制過敏小鼠體內(nèi)IL-4、IgE的產(chǎn)生，并抑制小腸中Th2反應，增加可以分泌IL-10的細胞數(shù)量。Fu Linglin等[48]通過研究對蝦原肌球蛋白致敏的小鼠模型，研究Bacillus coagulans 09.712對小鼠過敏反應的抑制作用，結(jié)果表明過敏小鼠血清中IL-10質(zhì)量濃度降低，Bacillus coagulans 09.712可以促進IL-10的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1/Th2/Treg細胞平衡，改善過敏反應。

2.3.7 IFN-γ的變化

IFN-γ是由活化的Th1細胞、NK細胞產(chǎn)生、分泌的。IFN-γ有多種生物活性：如促進巨噬細胞活化；促進MHC-II類分子的表達，提高APC抗原遞呈能力；促進MHC-I類分子的表達，增強NK細胞的殺傷活性；促進B細胞的分化、增殖；抑制Th2細胞分化及細胞因子合成[49-50]。

圖9 豚鼠血清中IFN-γ質(zhì)量濃度Fig.9 IFN-γ levels in serum of guinea pigs

由圖9可知，各組豚鼠血清中IFN-γ質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05）。陰性對照組IFN-γ質(zhì)量濃度為（38.461f1.173）ng/L，陽性對照組IFN-γ質(zhì)量濃度為（36.027f1.408）ng/L。IFN-γ是Th1細胞具有代表性的細胞因子。由2.3.3節(jié)結(jié)果可知，IL-4質(zhì)量濃度明顯升高，表明Th0細胞主要向Th2細胞分化，Th1細胞量減少。但NK細胞也可以產(chǎn)生IFN-γ，而IL-2、TNF-α等細胞因子都可以上調(diào)NK細胞分化并促進其活化，因此使得IFN-γ質(zhì)量濃度維持在一個穩(wěn)定的水平，未發(fā)生明顯的降低[32]。因此，IFN-γ與食物過敏相關(guān)性較小。張浩等[24]通過卵白蛋白建立致敏的小鼠模型，研究食物過敏小鼠血清中細胞因子的變化，結(jié)果表明過敏小鼠血清中IFN-γ質(zhì)量濃度沒有明顯變化。

2.3.8 TNF-α的變化

TNF-α是由巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生、分泌的。TNF-α可以激活血管內(nèi)皮、增加血管通透性、使白細胞聚集在炎癥的部位；會引起機體發(fā)熱，誘導急性期蛋白合成及釋放，參與炎癥反應；可以刺激巨噬細胞的合成以及細胞因子的分泌；增強吞噬細胞的作用[49-50]。

圖10 豚鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度Fig.10 TNF-α levels in serum of guinea pigs

由圖10可知，陽性對照組與其他組血清中TNF-α質(zhì)量濃度均有顯著性差異（P＜0.05），其他各組血清中TNF-α質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05）。該結(jié)果表明，高壓結(jié)合酶處理后的蝦仁及制品其致敏性的消減有顯著效果。因此，TNF-α與食物過敏具有相關(guān)性。

2.4 IFN-γ/IL-4的比值變化

在TH細胞中，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，主要介導機體細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，主要介導機體體液免疫應答，輔助抗體生成，在過敏反應中起主導作用[4-6]。Th1細胞分泌的IFN-γ和Th2細胞分泌的IL-4、IL-10不僅可促進自身的分化成熟，還可抑制對方的分化成熟，Th1分泌的IFN-γ可以抑制Th0向Th2分化；而Th2分泌的IL-4、IL-10可以增強Th2細胞而抑制Th1細胞的生成，同時與其他各種因素形成一個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。過敏個體T細胞發(fā)生變化的直接結(jié)果就是影響Th1和Th2細胞對細胞因子的分泌，從而對機體的免疫起作用[32]。

IFN-γ和IL-4可以分別代表Th1和Th2免疫應答的水平，目前研究中也多采用IFN-γ/IL-4動態(tài)來反映Th1/Th2免疫平衡的狀況[51-52]。IFN-γ/IL-4變化情況如圖11所示。

圖11 豚鼠血清中IFN-γ/IL-4Fig.11 IFN-γ/IL-4 ratio in serum of guinea pigs

由圖11可知，陰性對照組IFN-γ/IL-4為1.069f0.012，陽性對照組IFN-γ/IL-4為0.557f0.046，二者存在顯著性差異（P＜0.05）。隨著蝦過敏原的消減（組5樣品致敏性消減率為97.04%、組6樣品致敏性消減率為95.00%、組7樣品致敏性消減率為94.50%），各樣品組血清中IFN-γ/IL-4也呈現(xiàn)規(guī)律性變化，且與陽性對照組呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。該結(jié)果表明，食物過敏反應是以Th2型淋巴細胞占優(yōu)勢的過敏性疾病，食物過敏豚鼠的Th1/Th2細胞平衡向Th2細胞偏移。

方栓鋒等[53]通過用卵清蛋白致敏的小鼠模型，研究鼠李糖乳桿菌對小鼠食物過敏反應的抑制作用，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌可以有效的改善小鼠的過敏癥狀，小鼠血清中IL-4/IFN-γ降低，即抑制了Th1/Th2細胞平衡向Th2細胞偏移，調(diào)節(jié)了小鼠體內(nèi)Th1/Th2細胞平衡。Zhang Lili等[23]在研究雙歧桿菌對小鼠過敏反應的抑制作用時，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以增加分泌IL-10的細胞數(shù)量。張秋香等[54]研究了L. casei Zhang對食物過敏的抑制作用，發(fā)現(xiàn)口服L. casei Zhang的實驗組小鼠血清特異性IgE、糞便HIS和IL-4含量明顯降低，L. casei Zhang可以抑制食物過敏反應，促使Th2優(yōu)勢反應向Th1方向轉(zhuǎn)變，從而起到預防和治療花生過敏的作用。

3 結(jié) 論

通過食物過敏豚鼠血清中IgE和HIS質(zhì)量濃度變化，及血清中部分細胞因子的檢測，發(fā)現(xiàn)初次致敏和致敏后激發(fā)能夠引發(fā)豚鼠體內(nèi)IgE和HIS分泌量的增加；IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α等細胞因子質(zhì)量濃度與食物的致敏性強弱呈正相關(guān)，IL-10質(zhì)量濃度與食物致敏性強弱呈負相關(guān)。食物過敏豚鼠血清IFN-γ/IL-4與致敏性強弱呈負相關(guān)，顯示出食物過敏豚鼠的Th1/Th2細胞平衡向Th2細胞偏移。