張?jiān)t，楊玉輝，王雅楠，張佳紅，郭海濤，施用暉，樂國偉*

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國膳食營養(yǎng)模式已逐漸從低脂的植物性食物為主轉(zhuǎn)向與高脂的動(dòng)植物性食物并重[1]，這種高脂飲食模式會增加肥胖發(fā)生的幾率[2-3]，導(dǎo)致血脂異常[4]、誘發(fā)心血管疾病[5]、引起慢性炎癥反應(yīng)[6]和腸道氧化應(yīng)激[7]等。腸道氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致腸道功能損傷，甚至引起炎癥性腸道疾病[8]，對腸道產(chǎn)生不可逆損傷。有研究報(bào)道了腸道損傷會引起腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)[9]；也有研究證明了腸道菌群與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[10]；腸道菌群是動(dòng)物發(fā)生肥胖的前提，無菌小鼠即使吃高脂飼料也不會肥胖[11]；接受肥胖鼠糞菌移植的無菌小鼠體質(zhì)量增加量顯著高于接受瘦鼠糞菌移植的[12]。目前我國超重和肥胖人群已接近總?cè)丝诘?/4，肥胖的防治工作迫在眉睫[13]。因此，研究如何改善高脂飲食誘導(dǎo)的腸道氧化應(yīng)激和腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)對肥胖的預(yù)防和控制具有非常重要的意義。

Orentreich等[14]首次發(fā)現(xiàn)飲食蛋氨酸限制（methionine restriction，MR）對健康產(chǎn)生有益影響，他們發(fā)現(xiàn)將飲食中蛋氨酸的含量從0.86%限制至0.17%能夠使大鼠壽命延長30%～40%而不會影響其正常生長；后續(xù)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)飲食MR能在不限制能量攝入的情況下減輕動(dòng)物體質(zhì)量[15]，還產(chǎn)生諸多有益于機(jī)體健康的影響，如延長動(dòng)物壽命[16]、改善機(jī)體代謝狀態(tài)、延緩癌癥惡化進(jìn)程[17]等。此外，Sanz等[18]還發(fā)現(xiàn)飲食MR可以減少肝臟和心臟線粒體活性氧自由基的產(chǎn)生，提示MR可能具有緩解機(jī)體氧化應(yīng)激的作用。然而MR對高脂飲食小鼠腸道氧化還原狀態(tài)和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食的C57BL/6小鼠為研究對象，來探究飲食MR對高脂飲食小鼠腸道氧化還原狀態(tài)以及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為肥胖誘導(dǎo)腸道氧化應(yīng)激和腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡的預(yù)防和控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SP F級雄性C 57 BL/6小鼠（4 周齡，體質(zhì)量18～20 g）購自南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號：SCXK（蘇）2015-0001。

蛋氨酸（食品級，蛋氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.93%）為市售；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidizided glutathione，GSSG）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒 上海豐匯醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、LPS結(jié)合蛋白（LPS-binding protein，LBP）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）、基因引物 上海捷瑞生物工程有限公司；2hTaq PCR Master Mix 上海睿迪生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 上海生工生物工程有限公司；糖原核酸助沉劑、去離子甲酰胺 上海江萊生物；快速內(nèi)切酶HhaI、MspI和BCA試劑盒 美國Thermo Scientif i c公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Epoch微孔板分光光度計(jì) 美國BioTek公司；5804R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；R686VLT超低溫冷凍冰箱 美國Invetro公司；ETC811 PCR擴(kuò)增儀 東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；Precellys 24-Dual多功能生物樣品均質(zhì)機(jī) 法國Bertin公司；7900HT Fast Real-Time PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

27 只SPF級雄性C57BL/6小鼠用正常飼料預(yù)飼喂一周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3 組，每組9 只：1）低脂正常飲食組（C組：4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）豬油、0.86%蛋氨酸）；2）高脂正常蛋氨酸飲食組（HM組：20%豬油、0.86%蛋氨酸）；3）高脂蛋氨酸限制飲食組（LM組：20%豬油、0.17%蛋氨酸）。每周稱量并記錄體質(zhì)量，12 周末處死小鼠。飼料配方參考文獻(xiàn)[19]。

實(shí)驗(yàn)期間小鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，每籠3 只，飼養(yǎng)溫度（23f2）℃、相對濕度60%，12 h晝夜循環(huán)光照。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)樣本收集

在麻醉狀態(tài)下以摘眼球方式取血于抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，－80 ℃保存?zhèn)溆?。斷頸處死小鼠，迅速取出回腸、盲腸和結(jié)腸。取部分回腸和部分結(jié)腸，用于抗氧化指標(biāo)檢測，盲腸內(nèi)容物和結(jié)腸內(nèi)容物用于提取菌群DNA。取100 mg回腸組織置于Trizol試劑中，－80 ℃保存用于提取總RNA。

1.3.3 指標(biāo)檢測

血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、LPS和LBP水平均嚴(yán)格依照試劑盒說明書檢測?；啬c和結(jié)腸組織T-AOC、GSH-Px、MDA、GSH和GSSG水平均嚴(yán)格依照試劑盒說明書檢測。

1.3.4 盲腸內(nèi)容物及結(jié)腸內(nèi)容物DNA提取

內(nèi)容物處理參照Wang Panpan等[20]的方法，后續(xù)步驟按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書操作。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol法提取回腸組織的總RNA，然后加入適量焦碳酸二乙酯水稀釋，通過測定溶液中吸光度比值（A260nm/A280nm）確定提取的RNA純度，測得吸光度在1.8～2.0時(shí)可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

以β-actin為內(nèi)標(biāo)，測定回腸組織TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平，引物如表1所示。使用7900 HT Fast Real-Time PCR儀檢測各模板的Ct值，通過2-ΔΔCt法計(jì)算，進(jìn)行相對定量，反應(yīng)體系：0.5 μL cDNA模板、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL、5.0 μL SYBR Green Master Mix和3.7 μL無菌水。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40 次；72 ℃終末延伸2 min；4 ℃冷卻恒定。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table1 Sequences of the primers used in real-time PCR

1.3.6 限制性末端酶切

限制性末端酶切（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）參照Wang Panpan等[20]的方法對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，熒光標(biāo)記的通用引物為8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3’，5’端標(biāo)記FAM）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，5’端標(biāo)記HEX），擴(kuò)增體系包括2hTaq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、20 ng/μL DNA 3 μL、ddH2O加至25 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物用快速內(nèi)切酶HhaI、MspI酶切，內(nèi)切酶消化體系包括滅酶水17 μL、10hFastDigest 2 μL、DNA 10 μL、FastDigest enzyme 1 μL，消化完成后立即放入70 ℃的水浴鍋內(nèi)滅活內(nèi)切酶。對得到的酶切產(chǎn)物脫鹽純化，脫鹽步驟參照Wang Panpan等[20]的方法，脫鹽產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行分析。

1.3.7 結(jié)腸內(nèi)容物高通量測序分析

將樣本寄送至華大基因公司（每組隨機(jī)取4 個(gè)），采用Illumina（HiSeq 2500/4000）測序平臺，通過分析菌基因的16S rRNA v4區(qū)域基因序列來分析小鼠結(jié)腸菌群。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，One-way ANOVA和Duncan’s test分析差異顯著性，P＜0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MR對高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 蛋氨酸限制對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和體質(zhì)量增加的影響（n＝ 9）Fig.1 Effect of MR on body mass and mass gain of HFD-fed mice (n = 9)

由圖1可見，各組小鼠初始體質(zhì)量基本相同（P＞0.05）；至宰殺前第11周時(shí)，HM小鼠體質(zhì)量極顯著高于對照組（P＜0.01），LM小鼠體質(zhì)量極顯著低于HM小鼠（P＜0.01）。

2.2 MR對高脂飲食小鼠血脂的影響

表2 蛋氨酸限制對高脂飲食小鼠血脂的影響Table2 Effect of MR on lipid pro fi le of HFD-fed mice mmol/L

由表2可見，與C組相比，HM組小鼠極顯著升高血漿TG和LDL-C濃度（P＜0.01），顯著升高TC濃度（P＜0.05），極顯著降低HDL-C濃度（P＜0.01）；與HM小鼠相比，LM極顯著降低血漿TG和LDL-C濃度（P＜0.01），顯著降低TC濃度（P＜0.05），極顯著升高HDL-C濃度（P＜0.01）。

2.3 MR對高脂飲食小鼠回腸和結(jié)腸氧化還原狀態(tài)的影響

圖2 蛋氨酸限制對高脂飲食小鼠回腸和結(jié)腸組織氧化還原狀態(tài)的影響Fig.2 Effect of MR on redox homeostasis of ileum and colon in HFD-fed mice

由圖2可見，與對照組相比，HM顯著降低回腸T-AOC和GSH-Px活力（P＜0.05），顯著增加回腸MDA濃度（P＜0.05），極顯著降低結(jié)腸GSH-Px活力（P＜0.01），顯著增加結(jié)腸MDA濃度（P＜0.05），顯著降低結(jié)腸GSH/GSSG（P＜0.05）；與HM相比，LM顯著增加回腸T-AOC和GSH/GSSG（P＜0.05），顯著降低結(jié)腸MDA濃度（P＜0.05），顯著增加結(jié)腸GSH/GSSG（P＜0.05）。

2.4 MR對高脂飲食小鼠血漿LPS、LBP和回腸炎癥反應(yīng)的影響

圖3 蛋氨酸限制對高脂飲食小鼠血漿LPS、LBP和回腸炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of MR on the plasma levels of LPS and LBP and ileum inf l ammation in HFD-fed mice

由圖3可見，與對照組相比，HM極顯著升高血漿LPS質(zhì)量濃度（P＜0.01），顯著升高血漿LBP質(zhì)量濃度（P＜0.05），顯著上調(diào)回腸炎癥基因TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達(dá)水平（P＜0.05）；與HM組相比，LM組極顯著降低血漿LPS質(zhì)量濃度（P＜0.01），顯著降低LBP質(zhì)量濃度（P＜0.05），顯著下調(diào)回腸炎癥基因TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達(dá)水平（P＜0.05）。

2.5 MR對高脂飲食小鼠盲腸菌群的影響

由圖4A可見，HM組與C組及LM兩組區(qū)域明顯區(qū)分開，說明C、HM和LM 3 組小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)均有顯著性差異。圖4B中，與對照組相比，HM組Shannon-Weiner指數(shù)與均勻度指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與HM組相比，LM組Shannon-Weiner指數(shù)與均勻度指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。依次觀察圖4C結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HM組的優(yōu)勢片段有MH126.3，LM組的優(yōu)勢片段有HH393.9和HH270.5，C組與LM組共有的優(yōu)勢片段有MH74.1、MF81.6、MH84.5、HH132.2和HF188.0，說明各組小鼠盲腸內(nèi)容物中都有其特有的優(yōu)勢菌群。

圖4 T-RFLP分析盲腸菌群Fig.4 Analysis of cecal microbiota by terminal restriction fragment length polymorphism

2.6 MR對高脂飲食小鼠結(jié)腸菌群的影響

圖5 結(jié)腸菌群OTU數(shù)量、PCA和β多樣性Fig.5 Analysis of colonic microbiota by high throughput sequencing

將獲得的Tags拼接和優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），共產(chǎn)生338 個(gè)OTU。由圖5可見，LM組的OTU數(shù)量最多（圖5A），根據(jù)每個(gè)樣品OTU的豐度文件計(jì)算出每個(gè)OTU在每個(gè)樣品的相對豐度，利用該豐度信息進(jìn)行PCA分析，結(jié)果表明各組結(jié)腸菌群組成有明顯差異（圖5B）；對樣品進(jìn)行聚類分析并計(jì)算樣品間距離，以判斷各樣品物種組成的相似性，樣品越靠近、枝長越短，說明兩個(gè)樣品的物種組成越相似，結(jié)果表明各組結(jié)腸菌群組成比較相似，組間差異明顯（圖5C）。

圖6 基于門水平的菌群豐度Fig.6 Taxonomic composition distribution in samples at the phylum level

圖7 基于屬水平的菌群豐度Fig. 7 Taxonomic composition distribution in samples at the genus level

圖8 基于門和屬水平的結(jié)腸菌群豐度Fig.8 Taxonomic composition distribution in samples at the phylum and genus level

由圖6～8可見，基于門、屬水平分析各組小鼠結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)：在門水平上，各組優(yōu)勢菌群有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）（圖6、圖8A）；其中與對照組相比，HM組顯著升高厚壁菌門及放線菌門豐度（P＜0.05），極顯著降低疣微菌門豐度（P＜0.01），與HM組相比，LM組顯著升高厚壁菌門豐度（P＜0.05），顯著降低疣微菌門豐度（P＜0.05）（圖8 A）；在屬水平上，各組優(yōu)勢菌群主要有Allobaculum、Akkermansia、擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（B i f i dobacterium）、顫螺桿菌屬（Oscillosporia）和蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）（圖7、8B）；其中與對照組相比，HM組降低雙歧桿菌、顫螺桿菌屬與Akkermansia豐度，顯著升高Allobaculum豐度，與HM組相比，LM組顯著升高Allobaculum、雙歧桿菌和顫螺桿菌屬豐度（P＜0.05），顯著降低Akkermansia豐度（P＜0.05）（圖8B）。

3 討 論

飲食MR能減輕高脂飲食引起的體質(zhì)量增加[21]，本實(shí)驗(yàn)中LM組體質(zhì)量顯著低于HM組，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的。高脂飲食能夠引起高血脂[3,23]，有研究報(bào)道飲食蛋氨酸限制能夠降低血脂水平[24]，本研究中飲食MR顯著降低了高脂飲食小鼠血漿中TC、TG和LDL-C濃度，顯著升高HDL-C濃度，與其研究結(jié)果一致。

高脂飲食是肥胖產(chǎn)生的主要原因之一，肥胖會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[25]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞氧化損傷程度。T-AOC能反映機(jī)體總抗氧化能力，可清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基，使機(jī)體氧化還原狀態(tài)保持平衡。GSH清除自由基后轉(zhuǎn)化為GSSG，也可反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)。Qiao Yi等[7]發(fā)現(xiàn)高脂飲食顯著增加腸組織MDA濃度，產(chǎn)生嚴(yán)重的腸道氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)飲食MR顯著增加回腸T-AOC，顯著降低結(jié)腸MDA濃度，顯著增加回腸與結(jié)腸GSH與GSSG的比值，說明飲食MR能夠顯著改善高脂飲食引起的小鼠腸道氧化應(yīng)激。

高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖往往伴隨著炎癥反應(yīng)[6]，包括腸道組織炎癥反應(yīng)[26]，主要表現(xiàn)為機(jī)體LPS水平升高，LPS與LBP結(jié)合進(jìn)一步刺激單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等促炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)中飲食MR顯著降低血漿LPS、LBP質(zhì)量濃度，顯著降低回腸基因TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)，說明飲食MR能夠顯著減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥反應(yīng)。

腸道菌群能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物的脂肪積累，是動(dòng)物肥胖發(fā)生的必要條件[27]。研究發(fā)現(xiàn)膳食因素能夠顯著影響腸道菌群結(jié)構(gòu)[28]。Shannon-Weiner指數(shù)用于評價(jià)腸道菌群多樣性，值越大表明腸道菌群多樣性越高；均勻度指數(shù)反映腸道菌群中全部細(xì)菌分配的均勻程度，值越大表明腸道菌群均勻度越高。通過T-RFLP分析小鼠盲腸菌群，飲食MR顯著增加Shannon-Weiner指數(shù)和均勻度指數(shù)，說明飲食MR能夠增加高脂飲食小鼠盲腸菌群的多樣性和菌群的均勻度。

相比于T-RFLP，高通量測序能夠更加準(zhǔn)確、深入地分析小鼠腸道菌群的組成。因此，本實(shí)驗(yàn)通過Illumina測序平臺分析了小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的菌群，結(jié)果分析表明飲食MR顯著增加雙歧桿菌和顫螺桿菌屬豐度，顯著降低Akkermansia豐度。雙歧桿菌作為益生菌，具有增強(qiáng)腸道屏障[29]、抗LPS誘導(dǎo)腸道炎癥的作用[30]。本實(shí)驗(yàn)中飲食MR減輕炎癥的作用可能與雙歧桿菌豐度升高有關(guān)。顫螺桿菌屬在炎癥性疾病如克羅恩病、非酒精性脂肪肝炎患者體內(nèi)的豐度顯著下降[31]，其豐度與人的身體質(zhì)量指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[32]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食引起的小鼠炎癥反應(yīng)加劇和體質(zhì)量增加與這些研究結(jié)果是一致的；飲食MR能夠減輕高脂飲食小鼠腸道炎癥反應(yīng)和降低體質(zhì)量與其增加顫螺桿菌屬豐度的結(jié)果是一致的。這些結(jié)果說明了飲食MR可能通過增加腸道雙歧桿菌和顫螺桿菌屬豐度來緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。黏液層作為腸道屏障具有阻止腸道細(xì)菌入侵的免疫功能，而Akkermansia能夠降解黏液層蛋白[33]，在一定條件下能損害機(jī)體健康。Ganesh等[34]研究發(fā)現(xiàn)Akkermansia可加劇鼠傷寒沙門氏菌感染的無菌小鼠的腸道炎癥。因此，推測可能是高脂飲食時(shí)Akkermansia過度分解黏液層，破壞腸道屏障，在飲食MR時(shí)機(jī)體降低其豐度以防黏液層被過度分解而影響腸道黏膜屏障，但其具體機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，本研究探究了飲食MR對高脂飲食小鼠腸道氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明飲食MR具有顯著改善高脂飲食小鼠腸道組織氧化還原狀態(tài)、炎癥反應(yīng)和腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。