李弓中，趙 英，王俊彤，遲玉杰*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋清液中約含有88%的水分，干物質(zhì)中有著豐富的蛋白質(zhì)，占干基質(zhì)量的90%以上，其余為極少的脂質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等。蛋清液中蛋白質(zhì)的氨基酸組成模式最接近合成人體組織蛋白質(zhì)所需的氨基酸模式，吸收利用率高達(dá)99.6%，是食品中最理想的蛋白質(zhì)資源[1-2]。同時(shí)，蛋清液的起泡性質(zhì)廣泛應(yīng)用于冷飲和焙烤等食品中，能有效改善食品的質(zhì)地[3]，是重要的食品原輔料[4]。

為拓展蛋清液在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍并提高含蛋清產(chǎn)品的品質(zhì)，常用一些方法來改善其起泡性，但蛋清液具有熱敏性較強(qiáng)[5]、易受外來添加物質(zhì)的污染且不易去除等特點(diǎn)，制約了其發(fā)展。因此，采用適宜的物理方法如超聲波[6]、高壓脈沖[7]和超高壓[8]等改性蛋清液的研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞。其中超聲波處理以環(huán)保及耗能低的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[9]。應(yīng)用超聲波技術(shù)一般分為頻率100 kHz～1 MHz、場(chǎng)強(qiáng)低于1 W/cm2的高頻率低場(chǎng)強(qiáng)和頻率20～100 kHz、場(chǎng)強(qiáng)10～1 000 W/cm2的低頻率高場(chǎng)強(qiáng)兩種[10]，其中高頻率低場(chǎng)強(qiáng)的聲學(xué)特征多用于食品的無損檢測(cè)，通常用低頻率高場(chǎng)強(qiáng)的超聲作用對(duì)食品的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行修飾[11]。當(dāng)采用超聲改性蛋白質(zhì)時(shí)，特別是超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，能夠產(chǎn)生空穴效應(yīng)、機(jī)械剪切和湍流等，從而形成局部瞬時(shí)的高壓和高溫[12]，影響氫鍵和疏水相互作用，改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象[13]。王一博[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在360 W處理10 min時(shí)，蛋清液的起泡性顯著提高。Jambrak等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%乳清蛋白溶液超聲處理10～30 min能夠顯著改善其起泡性。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于超聲作用于蛋清液改善其起泡性的研究多停留在工藝與現(xiàn)象上，而對(duì)于不同超聲作用下起泡性質(zhì)與結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)變化關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)超聲作用改變蛋白質(zhì)起泡性質(zhì)已有一定的研究，為進(jìn)一步揭示超聲作用下蛋清液的起泡性質(zhì)與結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)的變化關(guān)系，本研究采用脈沖式超聲處理（脈沖式超聲處理可以降低超聲作用期間產(chǎn)熱致使蛋清蛋白直接變性或聚集而帶來的不利影響）蛋清液，探討不同超聲時(shí)間對(duì)蛋清液的起泡性、泡沫微觀結(jié)構(gòu)、靜態(tài)流變學(xué)、熱力學(xué)及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化及其關(guān)系，以期為超聲技術(shù)在蛋清液上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，從而促進(jìn)中國(guó)蛋品行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋市售；鄰苯二甲醛、十二烷基磺酸鈉、DL-二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-(phenylamino)naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS） 美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、硼酸、四硼酸鈉、無水乙醇磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌機(jī) 上海浦東物理化學(xué)儀器廠；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Ni-U熒光顯微鏡 日本Nikon公司；JJ-2B高速組織搗碎機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；inVia顯微拉曼光譜儀 英國(guó)雷尼紹公司；DSC 204-F型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC） 德國(guó)Netzsch公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Bohlin Gemini 2旋轉(zhuǎn)流變儀、Mastersizer 2000激光粒度儀英國(guó)馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲處理蛋清液樣品的制備

取新鮮雞蛋清洗，打蛋、分蛋取蛋清，于室溫下對(duì)蛋清進(jìn)行剪切稀釋，用紗布過濾得到新鮮蛋清液。取適量的新鮮蛋清液，將超聲設(shè)備的鈦探頭插入到蛋清液樣品液面以下2/3處[16]，在超聲頻率20 kHz、輸出功率580 W條件下分別處理0、5、10、15、20、25、30 min。

1.3.2 拉曼光譜的測(cè)定

參照Chang Cuihua等[17]的方法，將不同超聲時(shí)間下的蛋清液樣品平鋪在載玻片上進(jìn)行拉曼光譜的測(cè)定，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，激發(fā)功率25 mW，掃描范圍400～2 000 cm－1，每次掃描60 s，積分10 次，掃描4 次累加。運(yùn)用OMNIC軟件進(jìn)行基線校正和譜峰歸屬，以苯丙氨酸（1 002f1）cm－1的譜峰強(qiáng)度作為歸一化因子對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.3 內(nèi)源性熒光光譜的測(cè)定

取適量不同超聲時(shí)間的蛋清液樣品，用0.02 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋200 倍體積，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、掃描范圍300～470 nm、狹縫寬度5 nm下掃描。

1.3.4 靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

參照Nesterenko等[18]的方法并略有修改。對(duì)不同超聲時(shí)間下的蛋清液樣品進(jìn)行靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。測(cè)試前樣品在室溫（25 ℃）下放置1 h。樣品置于流變儀感應(yīng)板上，使用C60平板進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定剪切速率范圍0.01～100 s－1，板間距為1 000 nm，平板邊緣過量的樣品用塑料刮鏟除去。運(yùn)用Power Law模型（方程）對(duì)剪切速率和剪切應(yīng)力進(jìn)行回歸擬合。以剪切速率為橫坐標(biāo)，表觀黏度（η）為縱坐標(biāo)，繪制剪切速率與表觀黏度的關(guān)系圖。運(yùn)用Ostwald-de Waele冪次定律模型（公式（1））[19]對(duì)關(guān)系圖進(jìn)行回歸擬合。

式中：K為黏稠系數(shù)；γ為剪切速率/s－1；n為流體指數(shù)。

1.3.5 粒徑的測(cè)定

參照Tang等[20]的方法稍作修改，將樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL以下，放入臺(tái)式離心機(jī)中以5 000 r/min離心15 min，用激光粒度儀測(cè)定。設(shè)置蛋白折射率1.46，吸收參數(shù)1.33。

1.3.6 巰基含量的測(cè)定

使用Ellman’s法[21]測(cè)定不同超聲時(shí)間處理蛋清液的巰基含量。

表面巰基含量的測(cè)定：取適量樣品用pH 8.0 Tris-Gly緩沖液（含4 mmol/L EDTA）稀釋至100 mL，取5 mL稀釋液，加入0.1 mL Ellman’s試劑。室溫避光振蕩1 h，充分反應(yīng)后于6 000 r/min離心10 min，取上清液用紫外-可見分光光度計(jì)在412 nm處測(cè)定吸光度。以Ellman’s試劑為空白對(duì)照。

總巰基含量的測(cè)定：取適量樣品用pH 8.0 Tris-Gly緩沖液（含4 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素）稀釋至100 mL，余下步驟與表面巰基含量的測(cè)定方法一致。

巰基含量按公式（2）計(jì)算。

式中：A412nm為樣品在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；D為樣品的稀釋倍數(shù)；ρ為干物質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

參照Voutsinas等[22]的ANS探針法并稍作修改。將蛋清液樣品稀釋至蛋白質(zhì)量濃度0.062 5～0.800 0 mg/mL之間，并制成5 個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度，各取4 mL分別加入20 μL ANS溶液（含8 mmol/L ANS、20 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），混合，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm、狹縫寬度5 nm條件下測(cè)其熒光強(qiáng)度。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，作圖得出斜率即為樣品表面疏水性。

1.3.8 DSC的測(cè)定

參照Yin Shouwei等[23]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取10 μL待測(cè)樣品置于鋁盒中，密封，以空鋁盒為對(duì)照進(jìn)行基線校正。在溫度區(qū)間20～120 ℃、掃描速率10 ℃/min下測(cè)定。由DSC圖得出變性溫度（Td）和熱變性焓（ΔH）。

1.3.9 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

采用機(jī)械攪打法[24]，略有修改。取適量的蛋清液用pH 9.0硼酸-氫氧化鈉緩沖液稀釋10 倍體積，記錄此時(shí)的體積（V0）；用高速組織搗碎機(jī)在室溫下以12 000 r/min攪拌1 min，移至量筒中，立刻記錄下泡沫的體積（V1）；室溫下靜置25 min后，記錄下泡沫的體積（V2）。

起泡性與泡沫穩(wěn)定性計(jì)算公式如式（3）、（4）所示。

1.3.10 泡沫微觀結(jié)構(gòu)觀察

取未超聲處理與分別超聲處理15 min和30 min的蛋清液樣品用高速組織搗碎機(jī)攪打起泡，取適量泡沫平鋪在載玻片上形成薄層，將載玻片置于熒光正置顯微鏡下，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5 次，結(jié)果用fs表示，利用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析（單因素方差分析法），P＜0.05為顯著性差異；采用Origin Pro 8.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和圖譜處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時(shí)間對(duì)蛋清蛋白的拉曼光譜分析

2.1.1 蛋清蛋白主鏈構(gòu)象分析

拉曼光譜下的蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象復(fù)雜多變，主要是由肽鍵（—COüNH—）和CüC、CüN骨架引起的，肽鍵引起不同類型的振動(dòng)譜帶，例如酰胺A、B帶和酰胺I、II、III、IV、V、VI、VII帶[25]，其特征拉曼光譜范圍和指認(rèn)見表1。

通常情況下，通過對(duì)酰胺I帶進(jìn)行定量分析，解析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[26]。由表2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋清蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量先降低后增加，β-折疊結(jié)構(gòu)含量持續(xù)減少，而無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量的變化相對(duì)不規(guī)律。這可能是由于前期的超聲處理?xiàng)l件使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋清蛋白趨于無序的狀態(tài)，同時(shí)β-折疊含量的降低有利于蛋清液表面疏水性的增加[27]。后期的超聲作用使α-螺旋含量增加，β-折疊含量繼續(xù)減少，這可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用使分散的蛋白質(zhì)分子再次發(fā)生聚集[28]，或者高強(qiáng)度的超聲作用改變了蛋白質(zhì)氫鍵的取向，使蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。Chandrapala等[29]報(bào)道了在較強(qiáng)的超聲強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)生β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，與本研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含有較多的氫鍵，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中不含有氫鍵；氫鍵能夠影響蛋白質(zhì)分子的剛性和柔性，α-螺旋和β-折疊含量因超聲作用而降低，說明超聲能夠增加蛋白質(zhì)分子的柔性結(jié)構(gòu)。

表1 酰胺譜帶的特征拉曼光譜頻率的初步指認(rèn)Table1 Characteristic Raman frequency of amide bands and tentative attribution

表2 不同超聲時(shí)間下蛋清蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table2 Secondary structure contents in EWP at different ultrasonic treatment times

2.1.2 蛋清蛋白側(cè)鏈構(gòu)象分析

2.1.2.1 二硫鍵含量分析

蛋白質(zhì)和多肽的二硫鍵通常有3 種構(gòu)象，在（510f5）cm－1附近的譜線屬于扭曲-扭曲-扭曲構(gòu)象（g-g-g），在（525f5）cm－1附近的譜線屬于扭曲-扭曲-反式構(gòu)象（g-g-t），在（540f5）cm－1附近的譜線屬于反式-扭曲-反式構(gòu)象（t-g-t）[30]。由圖1和表3可知，超聲時(shí)間在5 min時(shí)，在500～550 cm－1處譜線主要在520 cm－1以內(nèi)，與未超聲處理的蛋清蛋白的二硫鍵構(gòu)象相同，均為g-g-g構(gòu)象。而隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，二硫鍵逐漸向g-g-t構(gòu)象轉(zhuǎn)變。因此，5～30 min超聲處理能夠改變蛋清蛋白質(zhì)的二硫鍵構(gòu)象。

圖1 不同超聲時(shí)間下蛋清蛋白質(zhì)的拉曼光譜Fig.1 Roman spectra of EWP at different ultrasonic treatment times

表3 不同超聲時(shí)間下蛋清蛋白質(zhì)的特征峰歸屬Table3 Attribution of characteristic bands in Raman spectra of EWP at different ultrasonic treatment times

2.1.2.2 酪氨酸殘基與色氨酸殘基分析

圖2 不同超聲時(shí)間下I850/I830和I1 363/I1 338Fig.2 I1 363/I1 338 and I850/I830 ratio of EWP at different ultrasonic treatment times

酪氨酸與色氨酸對(duì)于微環(huán)境和聚集狀態(tài)的變化非常敏感，通常用酪氨酸對(duì)羥苯基環(huán)的呼吸振動(dòng)（830 cm－1）和環(huán)平面外彎曲振動(dòng)（850 cm－1）的費(fèi)米共振譜線強(qiáng)度比（I850/I830）以及色氨酸費(fèi)米共振譜線（1 338 cm－1和1 363 cm－1）強(qiáng)度比（I1363/I1338）分別表征酪氨酸殘基和色氨酸殘基的變化[31]。

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，I850/I830變化規(guī)律不明顯，均處于0.90～1.20范圍之內(nèi)，表明酪氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中或者作為弱氫鍵的供體和受體。經(jīng)過超聲處理后，I850/I830均高于未超聲處理的樣品，說明超聲作用可能使酪氨酸殘基暴露，或作為弱氫鍵的受體增加。I1363/I1338隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，表明在超聲15 min之內(nèi)色氨酸殘基趨向于“暴露的”展開形式，導(dǎo)致周圍環(huán)境疏水性增加[32]；而20 min后色氨酸殘基趨向于“埋藏的”微環(huán)境，因而疏水性降低。Stefanovic等[33]在研究超聲作用對(duì)蛋清粉功能性質(zhì)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的超聲作用使蛋清蛋白疏水性降低。這說明適當(dāng)時(shí)間的超聲可以使色氨酸殘基趨于“暴露的”展開形式，從而增加蛋清液的疏水性，有利于提高其起泡性。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)蛋清蛋白內(nèi)源性熒光強(qiáng)度影響的分析

圖3 不同超聲時(shí)間下蛋清液內(nèi)源性熒光光譜Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on fl uorescence spectrum of EWP

當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm或295 nm時(shí)，蛋清蛋白中所含芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基產(chǎn)生熒光，即內(nèi)源性熒光[34]。由圖3可知，超聲處理蛋清液的內(nèi)源性熒光光譜的峰位并沒有發(fā)生明顯的紅移或者藍(lán)移現(xiàn)象，均在355 nm左右，而熒光強(qiáng)度因超聲作用時(shí)間不同而改變。通常情況下，可以通過熒光強(qiáng)度的改變判斷蛋清蛋白分子的伸展程度或芳香族氨基酸能量的傳遞[35]。由圖3可知，熒光強(qiáng)度隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，并在超聲處理15 min時(shí)達(dá)到最高；隨著超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，蛋清液的熒光開始猝滅，并在25 min和30 min的超聲處理中較未超聲處理組熒光強(qiáng)度更弱。這是由于超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)作用于蛋清液，使蛋白結(jié)構(gòu)松散，蛋清蛋白分子伸展，暴露出芳香族氨基酸特別是色氨酸殘基[36]，使熒光強(qiáng)度增大；超聲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)導(dǎo)致分散的蛋白質(zhì)分子再次聚集，從而將色氨酸殘基埋藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而使熒光猝滅，降低熒光強(qiáng)度，這與拉曼光譜的分析結(jié)果一致。

2.3 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液表觀黏度的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on apparent viscosity of LEW

表4 不同超聲時(shí)間的蛋清液流變學(xué)擬合參數(shù)Table4 Rheological parameters of LEW at different ultrasonic treatment times

從表4可知，R2＞0.98，表示圖4能較好地反映表觀黏度和剪切應(yīng)力的變化關(guān)系。所有樣品的n＜1，表示超聲處理并沒有改變蛋清液的流體性質(zhì)，均表現(xiàn)出了剪切稀釋的現(xiàn)象，且呈現(xiàn)出假塑性流體的性質(zhì)。因此，可對(duì)圖4中的曲線進(jìn)行Ostwald-de Waele冪次定律模型的回歸擬合，其中K值越大表示蛋清液表觀黏度越大[19]。從表4

中可以看出，經(jīng)超聲處理的蛋清液的黏度降低，且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋清液黏度呈逐漸下降趨勢(shì)，在超聲處理30 min時(shí)，蛋清液的K值與未超聲處理組相比降低了

75.7%。這是由于超聲所引起的空穴效應(yīng)與機(jī)械振蕩使蛋清液的體系分散，降低了蛋白質(zhì)分子間的凝集，超聲時(shí)間越長(zhǎng)效果越明顯；從拉曼光譜的分析中也可以看出超聲導(dǎo)致了蛋白質(zhì)二硫鍵構(gòu)象改變，從而減少了流動(dòng)阻力。n變化不規(guī)律，這可能是由于蛋清液中包含多種蛋白質(zhì)，各種蛋白質(zhì)在超聲作用下有不同的變化，這影響了蛋清液整體n的變化。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液粒徑的影響

圖5 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液粒徑分布的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on particle size distribution of LEW

圖6 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液平均粒徑的影響Fig.6 Effect of ultrasonic treatment time on average particle size of LEW

粒徑能夠反映蛋白質(zhì)分子間的分散和聚集等變化。由圖5、6可知，在超聲15 min內(nèi)，蛋清液的粒徑逐漸向小粒徑方向移動(dòng)且分布變窄，平均粒徑顯著下降（P＜0.05）。這可能是由于超聲產(chǎn)生的機(jī)械剪切和空穴效應(yīng)減弱了蛋清蛋白分子間的非共價(jià)相互作用，阻礙了蛋白的聚集，從而使其粒徑減小。而隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，20、25 min和30 min超聲處理的蛋清液粒徑向大粒徑方向移動(dòng)，且分布變寬，平均粒徑顯著增大，這是由于高強(qiáng)度超聲作用使分散的蛋白質(zhì)分子重新聚集，增大了蛋清液粒徑。Gülseren等[37]在超聲處理牛血清白蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)過長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用增大了牛血清白蛋白的平均粒徑。

2.5 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液理化性質(zhì)的影響

表5 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液各理化指標(biāo)的影響Table5 Effect of ultrasonic treatment time on physicochemical properties of LEW

由表5可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋清液的表面疏水性呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露時(shí)，蛋清液的疏水性就會(huì)提高，從蛋清液粒徑的分析中可以看出超聲能夠改變蛋白質(zhì)分子的聚集和分散，從而改變疏水基團(tuán)的暴露狀況，進(jìn)而改變蛋清液的疏水性。這與Chandrapala等[38]研究超聲作用于乳清濃縮蛋白時(shí)的結(jié)論一致。同時(shí)，蛋清液的表面疏水性與拉曼光譜分析中I1363/I1338的結(jié)果一致，表明超聲作用下I1363/I1338可以反映蛋清液疏水性的變化。表面巰基含量先降低后在超聲20 min時(shí)有增加的趨勢(shì)，這可能是由于超聲導(dǎo)致巰基暴露被氧化而含量降低，而長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用改變了蛋清蛋白的二硫鍵構(gòu)象，有可能發(fā)生了二硫鍵斷裂，轉(zhuǎn)變成表面巰基[37]，從而使表面巰基含量增加。Arzeni等[39]在研究超聲處理蛋白粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲對(duì)蛋清蛋白的表面巰基含量沒有顯著影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同。這可能是由于蛋清蛋白所處的溶液體系不同，本研究中超聲直接作用于蛋清液體系，而Arzeni等將超聲作用于蛋白粉溶液?？値€基含量的變化無明顯趨勢(shì)，但超聲作用使總巰基含量降低，這可能是發(fā)生了除二硫鍵與表面巰基轉(zhuǎn)化外其他的轉(zhuǎn)變，Hu Hao等[11]也發(fā)現(xiàn)超聲使大豆蛋白的總巰基含量降低。隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，Td沒有顯著變化（P＞0.05），這說明超聲作用沒有引起蛋清液變性溫度的改變。這與Arzeni等[40]的研究結(jié)果一致。ΔH能夠反映蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)所占的比例，15 min內(nèi)的超聲處理降低了ΔH，這是由于超聲處理降低了α-螺旋含量，破壞了蛋清蛋白的有序結(jié)構(gòu)；而隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，ΔH增加，這是由于超聲強(qiáng)度的增加使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，增加了α-螺旋含量。這在拉曼光譜的分析結(jié)果中有所體現(xiàn)。

2.6 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性是由兩類不同的分子性質(zhì)決定：起泡性是由蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散、界面張力和疏水基團(tuán)的分布等性質(zhì)決定；而泡沫穩(wěn)定性主要由蛋白質(zhì)膜的流變學(xué)性質(zhì)決定，如吸附膜中的蛋白質(zhì)水合程度、膜的厚度等。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)蛋清液起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of ultrasonic treatment time on foaming properties and foam stability of LEW

由圖7可知，起泡性隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小的變化趨勢(shì)（P＜0.05），且在15 min時(shí)達(dá)到最大，30 min時(shí)小于未超聲處理的蛋清液，達(dá)到最低。

圖8 未超聲處理（a）、超聲15 min（b）、超聲30 min（c）蛋清液泡沫在熒光正置顯微鏡下微觀圖像（×100）Fig.8 Microscopic images of LEW foams without ultrasonic treatment (a)and with ultrasonic treatment for 15 min (b) and 30 min (c) (× 100)

從圖8中發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行超聲處理的樣品泡沫較為疏散，體積大小不一。當(dāng)超聲15 min時(shí)，泡沫分布致密有序，體積趨向均一化，泡沫較多。而超聲30 min時(shí)的泡沫體積較大，并且出現(xiàn)大面積空隙。這說明適當(dāng)?shù)某曌饔媚軌蛱岣叩扒逡浩鹋菪缘脑蚴瞧涫沟扒宓鞍踪|(zhì)變得更加分散，折疊蛋白打開的更多，疏水基團(tuán)暴露，界面張力降低。而超聲30 min時(shí)起泡性比未超聲樣品低的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下的空穴效應(yīng)過強(qiáng)，產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和高壓破環(huán)了蛋清液的發(fā)泡體系，使分散的蛋白質(zhì)再次聚集，將疏水基團(tuán)藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部，同時(shí)減弱了蛋白質(zhì)多肽鏈之間的相互作用，降低了起泡性。這與拉曼光譜中I1363/I1338的變化一致，說明色氨酸的暴露情況影響超聲處理蛋清液起泡性的變化。

泡沫穩(wěn)定性隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)變化幅度不大，超聲處理0～10 min的蛋清液泡沫穩(wěn)定性顯著下降（P＜0.05），15 min后泡沫穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)，但總體上超聲處理降低了蛋清液泡沫穩(wěn)定性。這是由于黏度的變化影響著泡沫重力排液的松弛時(shí)間、氣體擴(kuò)散松弛時(shí)間和泡沫的半衰期。蛋清液黏度的降低致使蛋清蛋白質(zhì)分子間不能形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性降低。隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，黏度持續(xù)降低，泡沫穩(wěn)定性卻增加，這是因?yàn)槌曁幚韺⒎稚⒌牡鞍踪|(zhì)聚集成較小的蛋白質(zhì)聚集體，產(chǎn)生的天然粒子效應(yīng)有助于泡沫穩(wěn)定性的改善[41]。起泡性的降低和后期表面巰基含量的增加也是泡沫穩(wěn)定性升高的原因之一。

2.7 Pearson相關(guān)性分析

通過色階相關(guān)性分析表可以直觀地反映超聲處理蛋清液體系中起泡性、各理化結(jié)構(gòu)性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)可以驗(yàn)證上述的理論分析。

表6 色階相關(guān)性分析表Table6 Color rank correlation analysis

由表6的色階相關(guān)性分析可知，起泡性與表面疏水性、I1363/I1338的紅色塊較深，說明與其正相關(guān)性較大；與α-螺旋含量、ΔH、平均粒徑和表面巰基含量的綠色塊較深，說明與其負(fù)相關(guān)性較大。同理，泡沫穩(wěn)定性與表面疏水性負(fù)相關(guān)性較大；K值與β-折疊含量正相關(guān)性較大；表面疏水性與I1363/I1338正相關(guān)性較大，與表面巰基含量、ΔH、平均粒徑和α-螺旋含量負(fù)相關(guān)較大；表面巰基含量與ΔH、平均粒徑、α-螺旋含量正相關(guān)性較大，與I1363/I1338負(fù)相關(guān)性較大；ΔH與平均粒徑和α-螺旋含量正相關(guān)性較大，與I1363/I1338負(fù)相關(guān)性較大；平均粒徑與α-螺旋正相關(guān)性較大，與I1363/I1338負(fù)相關(guān)性較大。

3 結(jié) 論

采用脈沖式超聲設(shè)備處理蛋清液，在降低超聲期間產(chǎn)熱所帶來不利影響的同時(shí)能顯著提高蛋清液的起泡性，當(dāng)超聲處理15 min時(shí)起泡性較佳，為74.4%，泡沫穩(wěn)定性為75.5%，泡沫微觀圖像分布均勻、緊密。此時(shí)蛋清液表面疏水性增大，表面巰基含量減小，ΔH和

α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少，I1363/I1338增大，內(nèi)源性熒光強(qiáng)度增大。因此，超聲是通過改變以上結(jié)構(gòu)性質(zhì)來影響起泡性的。泡沫穩(wěn)定性先小幅降低后上升，且不隨黏度的持續(xù)降低而降低，這與?mudziński等[42]對(duì)黏度對(duì)蛋清蛋白泡沫穩(wěn)定性影響的研究結(jié)果不一致，屬于超聲處理蛋清液特有的性質(zhì)。粒徑分析結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)分子在蛋清液中先分散后聚集，這影響著蛋清液的泡沫穩(wěn)定性。相關(guān)性分析驗(yàn)證了上述起泡性與各理化結(jié)構(gòu)性質(zhì)的關(guān)系。由靜態(tài)流變學(xué)分析可知，超聲時(shí)間的變化并沒有改變蛋清液的流體性質(zhì)，其依舊表現(xiàn)出假塑性流體的性質(zhì)。但超聲時(shí)間的延長(zhǎng)改變了蛋清蛋白質(zhì)的二硫鍵構(gòu)象，導(dǎo)致蛋清蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散不穩(wěn)定，致使蛋清液黏度降低。I850/I830在0.90～1.20之間變化不規(guī)律，說明

30 min的超聲處理對(duì)酪氨酸殘基的影響較小。本研究對(duì)超聲處理蛋清液的起泡性和結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)的分析為脈沖式超聲設(shè)備在蛋清液和其他天然混合蛋白質(zhì)方面的運(yùn)用和研究提供了一定的參考依據(jù)。