羅華彬，林 露，高 星，呂梁玉，李高尚，陳燕婷，張進杰，楊文鴿*

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211）

在熱誘導(dǎo)魚糜凝膠的形成過程中，當(dāng)通過40～60 ℃溫度帶時魚糜蛋白往往會發(fā)生嚴重降解，形成低彈性魚糜凝膠，甚至不能形成凝膠，這種凝膠劣化現(xiàn)象與魚糜內(nèi)源性蛋白酶的活性有關(guān)，肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP）和組織蛋白酶L（cathepsin L，Cat-L）等蛋白酶均會促使魚糜肌原纖維蛋白水解及肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）降解，影響魚糜凝膠形成[1-2]。如鯉魚肌原纖維與純化的絲氨酸蛋白酶在55 ℃反應(yīng)1 h，MHC、α-輔肌動蛋白和肌動蛋白均被降解，魚糜凝膠劣化，并發(fā)現(xiàn)在鯉魚魚糜中加入Cat-L會降低魚糜凝膠強度，而同時加入Cat-L及其抑制劑，凝膠強度則會增加，說明絲氨酸蛋白酶和Cat-L均是導(dǎo)致魚糜凝膠劣化的關(guān)鍵酶類[3]。Jiang等[4]認為殘留在鯖魚魚糜中的Cat-L可以降解肌球蛋白，引起鯖魚魚糜凝膠劣化；揭珍等[5]在不同溫度下保溫帶魚魚糜，發(fā)現(xiàn)在50～75 ℃時肌原纖維蛋白重鏈被降解，三氯醋酸-溶解肽含量增加，并在70 ℃時達到最高值，導(dǎo)致帶魚魚糜凝膠劣化。

作為較新興的食品冷殺菌技術(shù)，電子束輻照憑借其能減少農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后損失、提高食品加工品質(zhì)、控制食源性疾病發(fā)生等優(yōu)勢而越來越受到世界各國人們的重視[6-7]。研究表明，電子束輻照對食品蛋白等生物大分子具有獨特的改性作用，能引起蛋白化學(xué)作用力及其構(gòu)象的改變，導(dǎo)致蛋白變性、聚集或凝膠化，同時也能改變魚糜內(nèi)源性蛋白酶的結(jié)構(gòu)及其活性，從而影響魚糜凝膠的形成[8-9]。如Jaczynski等[10]研究了電子束輻照劑量對狹鱈魚魚糜蛋白結(jié)構(gòu)及其凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)魚糜蛋白的疏水性及二硫鍵含量、凝膠剪切力均隨輻照劑量的增加而增加，6～8 kGy輻照可有效改善狹鱈魚魚糜凝膠品質(zhì)；Lin Xianping[11]、Deng Siyao[12]等分別對帶魚魚糜和梅魚魚糜進行電子束輻照，發(fā)現(xiàn)輻照引起魚糜肌原纖維蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量升高，5～7 kGy輻照可以顯著提高魚糜凝膠強度，促進凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。為進一步闡述電子束輻照對魚糜凝膠特性的影響機理，本研究以不同劑量電子束輻照帶魚魚糜，提取各組魚糜內(nèi)源性MBSP和Cat-L，測定其活力及最適反應(yīng)溫度，通過圓二色光譜分析其二級結(jié)構(gòu)，探究電子束輻照對帶魚魚糜MBSP和Cat-L的影響，旨在為輻照技術(shù)應(yīng)用于魚糜及其制品的生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍帶魚魚糜（貯藏于－20 ℃） 寧波飛日水產(chǎn)實業(yè)有限公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA日本Peptide Institute公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；ML104/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機德國Thermo Scientific SORVALL公司；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；NBL-1020電子直線加速器 寧波超能科技股份有限公司；J-1500-150圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜輻照處理

將冷凍帶魚魚糜300 g/袋真空包裝，利用NBL-1020型電子直線加速器（能量10 MeV）進行輻照，輻照劑量分別為0、1、3、5、7、9 kGy，輻照劑量誤差小于3%，其中0 kGy為對照組。每組劑量設(shè)置3 個平行，輻照時各個樣品排列整齊，防止疊壓造成平行樣品之間的差異。對照組和各輻照組魚糜用于MBSP和Cat-L的提取，同時對照組魚糜用于肌原纖維蛋白的提取。

1.3.2 酶的提取

1.3.2.1 MBSP的提取

參考Cao Minjie等[13]的方法略作修改。取各組魚糜適量，加入3 倍體積20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）勻漿，8 000 r/min冷凍離心20 min。沉淀加入4 倍體積蒸餾水，調(diào)至pH 6.0，離心，重復(fù)3 次。沉淀加入4 倍體積蒸餾水，調(diào)至pH 6.0，55 ℃溫育5 min，10 000 r/min冷凍離心20 min。上清液調(diào)至pH 4.0，再次離心取上清液，調(diào)至pH 6.0，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）透析，冷凍干燥，低溫保存。

1.3.2.2 Cat-L的提取

參考Hu Yaqin等[14]的方法略作修改。取各組魚糜適量，加入4 倍體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液A（pH 6.8），勻漿，3 000 r/min冷凍離心10 min，重復(fù)2 次。沉淀加入3 倍體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液B（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）提取20 h，10 000 r/min冷凍離心30 min。上清液加10 倍體積蒸餾水，調(diào)至pH 6.8，3 000 r/min離心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液C（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）溶解，50 ℃保溫15 min，10 000 r/min冷凍離心20 min取上清液，用質(zhì)量分數(shù)80%硫酸銨沉淀，同時調(diào)至pH 5.5，靜置10 min后10 000 r/min冷凍離心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液D（含5 mmol/L L-半胱氨酸，pH 5.5）溶解，透析后10 000 r/min冷凍離心10 min取上清液。冷凍干燥，低溫保存。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肌原纖維蛋白

魚糜肌原纖維蛋白的提?。簠⒖糥iong Guangquan等[15]的方法略作修改。取2 g對照組魚糜，加20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分勻漿后10 000 r/min離心15 min，沉淀加入20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分勻漿，靜置提取1 h后10 000 r/min離心15 min，上清液即為魚糜肌原纖維蛋白溶液。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：將提取的MBSP、Cat-L分別配制成0.1 mg/mL酶液，各加5 mL 5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，55 ℃反應(yīng)10 min，得到肌原纖維蛋白酶解液。參照Laemmli[16]的方法進行SDS-PAGE，分離膠和濃縮膠質(zhì)量分數(shù)分別為10%和5%，酶解液上樣量10 μL，起始電壓80 V，溴酚藍指示劑進入分離膠后電壓改為100 V?？捡R斯亮藍R-250染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.3.4 酶活力的測定

1.3.4.1 MBSP活力的測定

參考Cao Minjie等[17]的方法。將MBSP溶于蒸餾水中，取MBSP溶液50 μL，依次加入900 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）和50 μL 10 μmol/L熒光底物，搖勻，55 ℃水浴加熱10 min，加入1.5 mL終止液（V（甲醇）∶V（正丁醇）∶V（蒸餾水）＝35∶30∶35）終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定熒光強度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為380 nm和450 nm。以每分鐘反應(yīng)生成1 mmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量為1 個酶活力單位（U/g）。

1.3.4.2 Cat-L活力的測定

參考Barrett等[18-19]的方法略作改動。將Cat-L溶于蒸餾水中，取Cat-L溶液50 μL，依次加入900 μL乙二胺四乙酸-乙酸鈉緩沖液（4 mmol/L乙二胺四乙酸、0.4 mol/L乙酸鈉，pH 5.5，含20 mmol/L半胱氨酸和50 μL底物（10 μmol/L Z-Phe-Arg-MCA）），搖勻，55 ℃水浴加熱30 min，加入3.0 mL 0.1 mol/L氯乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.5）終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測定熒光強度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為370 nm和460 nm。以每分鐘反應(yīng)生成1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量為1 個酶活力單位（U/g）。

1.3.5 MBSP、Cat-L最適反應(yīng)溫度的測定

參考1.3.4節(jié)的方法測定酶活力。反應(yīng)溫度分別設(shè)置為25、35、45、55、65、75、85 ℃，測定不同溫度下MBSP、Cat-L活力，確定輻照對MBSP、Cat-L最適溫度的影響。

1.3.6 圓二色光譜測定MBSP、Cat-L的二級結(jié)構(gòu)

參照Lee等[20]的方法略作修改。分別配制0.02 mg/L M B S P、C a t-L溶液，以蒸餾水為空白對照，在190～250 nm波長范圍進行光譜掃描，選用1 mm比色皿，測定溫度25 ℃，掃描速率50 nm/min，響應(yīng)時間0.25 s，每組樣品重復(fù)掃描3 次，累加得到圓二色光譜圖，圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減。利用儀器自帶軟件分析MBSP、Cat-L各二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設(shè)置3～6 個平行，數(shù)據(jù)用fs表示，采用Origin 9.0軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件中的Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照對魚糜MBSP、Cat-L活力的影響

圖1 電子束輻照對魚糜MBSP和Cat-L活力的影響Fig.1 Effect of electron beam irradiation on the activity of MBSP and Cat-L from surimi

如圖1所示，與對照組相比，輻照后MBSP活力顯著下降，為對照組的87.60%～82.64%，但輻照劑量對其影響不顯著。除1 kGy組Cat-L活力與對照組接近外，其余各劑量組Cat-L活力下降顯著，尤其是9 kGy組Cat-L活力只有對照組的52%。電子束輻照所產(chǎn)生的高能射線作用于食品組織中的水而產(chǎn)生—H、—OH等活性自由基，從而使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生斷裂、交聯(lián)等現(xiàn)象，改變蛋白質(zhì)的表面疏水性、羰基及巰基含量，影響其生化特性。顧可飛[21]研究了電子束輻照對液態(tài)多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的影響，他認為PPO活力隨輻照劑量的增加而降低，在輻照劑量為4.83 kGy和8.69 kGy時，PPO活力分別下降了53%和85%，輻照在一定程度上抑制了PPO活力。馬艷萍等[22]利用60Co-γ射線輻照鮮食核桃，發(fā)現(xiàn)0.5 kGy輻照能明顯提高核桃冷藏期超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力，抑制過氧化物酶、脂肪氧合酶活力?？梢姡椪諏γ富盍Φ挠绊懪c輻照劑量及酶的種類有關(guān)。MBSP和Cat-L屬于蛋白質(zhì)，輻照導(dǎo)致其活力降低與其結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

2.2 輻照對魚糜MBSP、Cat-L最適溫度的影響

圖2 輻照劑量和反應(yīng)溫度對魚糜MBSP活力的影響Fig.2 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of MBSP from surimi

圖3 輻照劑量和反應(yīng)溫度對魚糜Cat-L活力的影響Fig.3 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of Cat-L from surimi

由圖2、3可知，隨溫度升高，MBSP和Cat-L活力均先升高后降低。各組魚糜MBSP的最適溫度均為55 ℃，對照組和1 kGy組魚糜Cat-L的最適溫度為55 ℃，5 kGy及7 kGy組Cat-L的最適溫度在45～55 ℃之間，但3 kGy及9 kGy輻照對Cat-L的最適溫度產(chǎn)生影響，使其由55 ℃降低至45 ℃。鮑曉瑾[23]、Cao Minjie[13]等分別發(fā)現(xiàn)鳙魚和狗母魚MBSP的最適溫度均為50 ℃；胡亞芹等[24]發(fā)現(xiàn)南藍鱈魚糜Cat-L的最適溫度為45 ℃；從海參體表純化到的Cat-L的最適溫度為50～60 ℃[25]。本研究中2 種酶的最適溫度與上述結(jié)果接近，電子束輻照沒有改變帶魚魚糜MBSP的最適溫度；隨劑量的增加，Cat-L的最適溫度略有降低，但均在容易引起魚糜凝膠劣化的溫度帶40～60 ℃范圍內(nèi)，表明MBSP和Cat-L均有潛在的引起凝膠劣化能力。揭珍等[5]研究了溫度對帶魚魚糜肌原纖維蛋白的降解作用，認為在50～75 ℃時肌原纖維蛋白重鏈被降解，70 ℃時溶解肽含量達最高值，也和本研究MBSP和Cat-L在65～75 ℃時仍有較高活力的結(jié)果一致。

2.3 輻照對魚糜MBSP、Cat-L降解肌原纖維蛋白作用的影響

圖4 輻照對MBSP降解肌原纖維蛋白作用的影響Fig.4 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation of MBSP

圖5 輻照對Cat-L降解肌原纖維蛋白作用的影響Fig.5 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation ability of Cat-L

MBSP和Cat-L能有效降解肌原纖維中的MHC，而MHC的降解被認為是導(dǎo)致凝膠劣化的主要因素。分別用各組魚糜中提取的MBSP、Cat-L作用于肌原纖維蛋白，進一步利用SDS-PAGE進行分離，結(jié)果見圖4、5。圖5中對照組和1 kGy組中未見MHC條帶，但隨著輻照劑量的增加，圖4、5中的MHC條帶灰度明顯增加，尤其是9 kGy組，說明輻照減弱了魚糜MBSP和Cat-L對肌原纖維蛋白的降解作用；且相對于MBSP，Cat-L活性受輻照的影響更大。Jaczynski等[10]的研究發(fā)現(xiàn)輻照劑量越高，MHC的條帶越淺；Lin Xianping等[8]認為隨著輻照劑量增加至7 kGy和9 kGy，帶魚魚糜MHC降解較為明顯。說明輻照既能直接引起魚糜肌原纖維蛋白的降解，同時又能削弱魚糜MBSP和Cat-L對肌原纖維蛋白的降解，選擇合適的輻照劑量可以減輕肌原纖維蛋白被降解的程度，以促進魚糜形成凝膠。

2.4 輻照對MBSP、Cat-L二級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是多肽鏈借助氫鍵進行盤旋或折疊而形成的周期性有規(guī)律的構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種構(gòu)象單元。基于蛋白質(zhì)不同類型構(gòu)象單元吸光度的不同，圓二色光譜被廣泛應(yīng)用于蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定。對照組和各輻照組魚糜MBSP、Cat-L的圓二色光譜圖如圖6、7所示。

圖6 MBSP的圓二色光譜圖Fig.6 Circular dichroism spectra of MBSP

圖7 Cat-L的圓二色光譜圖Fig.7 Circular dichroism spectra of Cat-L

圖8 MBSP的二級結(jié)構(gòu)相對含量Fig.8 Relative contents of secondary structures in MBSP

圖9 Cat-L的二級結(jié)構(gòu)相對含量Fig.9 Relative contents of secondary structures in Cat-L

由圖8可知，輻照后魚糜MBSP分子中的α-螺旋和無規(guī)卷曲的相對含量下降，β-折疊相對含量增加，β-轉(zhuǎn)角相對含量除5 kGy組外變化不明顯；隨著輻照劑量的增加，MBSP分子中α-螺旋相對含量先減少后增加，β-折疊相對含量的變化則相反，至5 kGy時α-螺旋相對含量最?。?1.00%），而β-折疊相對含量最大（21.70%）。由圖9可知，隨著輻照劑量的增加，Cat-L分子中α-螺旋相對含量的變化趨勢與MBSP一致，5 kGy時α-螺旋相對含量最?。?6.90%），β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量的變化沒有明顯規(guī)律，而無規(guī)卷曲的相對含量除9 kGy組外其余均略有上升。

總體上，低劑量輻照（不超過5 kGy）可以促使兩種酶中的α-螺旋結(jié)構(gòu)向其他結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，而輻照劑量增加至7 kGy時α-螺旋相對含量又有回升。維持酶蛋白二級結(jié)構(gòu)的作用力主要為氫鍵，電子束輻照會引起氫鍵斷裂又重新形成，使二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元不斷互相轉(zhuǎn)變，而構(gòu)象單元的變化引起空間結(jié)構(gòu)的改變，最終影響其催化活性。吳燁[26]用圓二色光譜測定兔肌球蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在加熱過程中α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊和無規(guī)卷曲；Malik等[27]的研究發(fā)現(xiàn)輻照作用于向日葵蛋白，引起α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加；顧可飛[21]的研究表明在輻照劑量低于4.83 kGy時，PPO α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量變化不大，當(dāng)輻照劑量超過4.83 kGy時，隨著劑量的增加，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量不斷下降，而無規(guī)卷曲含量上升；鄧思瑤等[9]發(fā)現(xiàn)與未輻照魚糜相比，5 kGy輻照后魚糜蛋白α-螺旋含量下降，β-折疊和無規(guī)卷曲含量上升，而β-轉(zhuǎn)角含量無明顯變化，輻照處理使肌原纖維蛋白分子間氫鍵及分子間相互作用逐漸減弱；Herrero等[28]利用拉曼光譜研究了0～8 kGy電子束對鮭魚魚肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)8 kGy組魚肉蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，其中α-螺旋比例顯著下降，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比例增加；Lee等[20]采用圓二色光譜法分析γ射線對肌紅蛋白分子特性的影響，研究表明隨輻照劑量的升高，肌紅蛋白α-螺旋含量降低的同時無規(guī)卷曲含量升高；Moon等[29]采用圓二色光譜研究發(fā)現(xiàn)隨著輻射時間的延長或強度的增加，蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的破壞更加明顯；Guan Aiyan等[30]發(fā)現(xiàn)電子束輻照使中華管鞭蝦原肌球蛋白分子中的α-螺旋含量減少，而β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，導(dǎo)致其免疫原性的下降。可見，輻照對大多數(shù)蛋白來說會破壞其有序的構(gòu)象單元，改變其構(gòu)象單元的相對含量。本實驗中，當(dāng)輻照劑量在5 kGy及以下時，魚糜MBSP和Cat-L分子中穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量下降的同時，無規(guī)卷曲相對含量變化較小，而β-折疊相對含量升高?？梢娸椪諏Φ鞍锥壗Y(jié)構(gòu)的影響與劑量及蛋白種類有關(guān)，二級結(jié)構(gòu)的改變會影響其生物學(xué)功能。

3 結(jié) 論

電子束輻照處理引起帶魚魚糜內(nèi)源性MBSP、Cat-L二級結(jié)構(gòu)的變化，輻照后魚糜MBSP、Cat-L分子中的α-螺旋相對含量下降，從而影響其空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，導(dǎo)致MBSP和Cat-L活力降低，并一定程度上降低了MBSP和Cat-L對帶魚魚糜肌原纖維蛋白的降解；電子束輻照沒有改變帶魚魚糜MBSP的最適溫度，3 kGy及9 kGy輻照后魚糜Cat-L的最適溫度略有降低，但各組MBSP和Cat-L的最適溫度均在引起凝膠劣化的溫度帶（40～60 ℃）范圍內(nèi)，而且在高溫下仍有較高活力，因此在熱誘導(dǎo)魚糜凝膠形成過程中仍應(yīng)避開這一溫度帶，以免引起凝膠劣化。