鄧 慧, 李鑫雨, 吳燕丹, 王成海, 3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院), 江蘇 揚(yáng)州, 225009; 2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬揚(yáng)州洪泉醫(yī)院 病理科, 江蘇 江都, 225200; 3. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

大腸癌是成年人消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，多見于肥胖患者，包括結(jié)腸癌和直腸癌。在大腸癌的病理學(xué)分型中，腺癌占絕大多數(shù)，而鱗癌發(fā)生比例較低，常位于直腸肛門附近。超保守RNA(UCR)是一群絕對高度保守的長鏈非編碼RNA, 廣泛存在于不同生物物種中，如人、兔、鼠類等生物[1-3]。有趣的是，雖然生物物種不一樣，但所攜帶的超保守RNA基因序列卻高度一致。目前有許多研究[4-6]表明，超保守RNA參與了諸多生物學(xué)功能，影響正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測超保守RNA uc.189在大腸癌及相應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)水平，分析uc.189的RNA表達(dá)水平與大腸癌病理參數(shù)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

130例大腸癌及配對的癌旁正常組織標(biāo)本均來源于揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院普外科手術(shù)患者，采集時(shí)間為 2017年1月—2018年12月，患者年齡35～72歲，中位年齡為58歲; 男79例，女51例。所有患者手術(shù)前未經(jīng)過放療、化療等處理。標(biāo)本采集、使用及臨床資料的整理均經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。新鮮大腸癌組織采集后立即放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內(nèi)長期保存。病理組織學(xué)類型包括腺癌122例，鱗狀細(xì)胞癌8例; TNM分期包括Ⅰ期10例, ⅡA期16例, ⅡB期27例, ⅢA期46例, ⅢB期26例, Ⅳ期5例。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

uc.189與內(nèi)參U6的PCR引物序列由本實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)提供，引物序列的合成購自上海生工生物工程有限公司。引物序列如下: uc.189-上游引物: 5′-CAGAGTCACCATCATGTCTC-3′; uc.189-下游引物: 5′-AAGGCTGCTGCTGTAGTTGT-3′; U6-上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′; U6-上游引物: 5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3′。

1.3 樣本總RNA萃取

步驟如下: ① 首先取0.10～0.15 g新鮮腫瘤組織，放置在預(yù)冷的研缽里研磨成細(xì)粉狀。② 將細(xì)粉樣組織加入至含有1 mL TRizol的離心管中。③ 室溫下用力振蕩15 min, 使組織充分裂解，靜止數(shù)秒。④ 4 ℃離心10 min, 轉(zhuǎn)速12 000轉(zhuǎn)/min。⑤ 將上一步的上清液迅速加入200 μL氯仿，快速振蕩120 s, 并在室溫下不斷振蕩約5 min, 靜置120 s。⑥ 4 ℃離心10 min, 轉(zhuǎn)速12 000轉(zhuǎn)/min。⑦ 將上一步上清液迅速加入500 μL 異丙醇后置于新的離心管內(nèi)，緩慢顛倒離心管并沉淀20 min。⑧ 4 ℃離心10 min, 轉(zhuǎn)速12 000轉(zhuǎn)/min, 棄上清液。⑨ 在離心固態(tài)物質(zhì)中加入1 mL 75%酒精并緩慢顛倒棄上清，再加入1 mL 75%酒精使沉淀物質(zhì)懸浮, 4 ℃離心5 min, 轉(zhuǎn)速10 000轉(zhuǎn)/min, 棄上清。⑩ 自然干燥2 min, 加入10 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC) 處理的雙蒸水溶解?？俁NA提取后檢測光密度OD值，記錄后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 cDNA合成

購買并使用Takara生物工程公司逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒獲取cDNA。反應(yīng)體系共20 μL, RNA約50 ng, 5×PrimeScript Buffer 4 μL, PrimeScript RT EnzymeMix I 1 μL, 上下游引物各0.5 μL, 添加RNase-Free water 調(diào)整體系至20 μL。反應(yīng)條件37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 反應(yīng)產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱。

1.5 qRT-PCR

購買并使用Takara生物公司qRT-PCR反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL。cDNA為1 μL, 12×SYBR Premix ExTaqTMII 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, 加RNase-Free water調(diào)整體系至20 μL, 每組樣本有3個(gè)復(fù)孔, U6設(shè)置為內(nèi)參; 具體實(shí)驗(yàn)操作在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system儀器上進(jìn)行。最后讀取定量PCR反應(yīng)Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt(ΔCt=Ct(uc.189)-Ct(U6), uc.189的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt計(jì))。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析及作圖軟件進(jìn)行相關(guān)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示兩樣本間的差異，采用單因素方差分析比較uc.189在不同臨床病理特征中的表達(dá)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 uc.189在大腸癌組織中的相對表達(dá)

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 130例大腸癌組織中uc.189的表達(dá)為(3.323±1.304), 高于癌旁正常大腸組織中的(1.020±0.685), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.648，P<0.05)。見圖1。

與癌旁正常腸組織比較, ?P<0.05圖1 uc.189在大腸癌中的相對表達(dá)

2.2 uc.189在大腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在130例大腸癌組織中, uc.189高表達(dá)者112例(RNA相對表達(dá)量>1), 低表達(dá)或正常表達(dá)者18例(RNA相對表達(dá)量≤1), 而uc.189表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期均有顯著相關(guān)性(P<0.05), 與年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 大腸癌組織中uc.189表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

3 討 論

大腸癌是人類消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌。高脂、高蛋白和低纖維飲食是引發(fā)大腸癌的易感因素，其他因素包括遺傳、大腸炎癥、大腸腺瘤等。大腸癌在全世界的癌癥發(fā)病率中占第3位，在中國則占第5位，并且發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是結(jié)腸癌的發(fā)病率增長速度迅猛[7-9]。

超保守RNA是長鏈非編碼RNA分子，其堿基序列大于200個(gè)。文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道超保守RNA有483個(gè)，包括正鏈DNA 483個(gè)和反鏈DNA 483個(gè)[10], 其廣泛存在于人、兔、小鼠和大鼠等高等生物中，其DNA序列絕對保守相同。可轉(zhuǎn)錄成RNA分子的超保守RNA, 能調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)也能調(diào)控其他的RNA分子而影響相關(guān)的生物學(xué)功能等，從而進(jìn)一步調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與分化、侵襲轉(zhuǎn)移與預(yù)后，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程[4-6]。

目前，超保守RNA對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響已經(jīng)成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)，國外文獻(xiàn)[11-16]已對超保守RNA在肺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、白血病和膠質(zhì)瘤等腫瘤中的作用開展了大量的研究。uc.189是383個(gè)超保守RNA(UCRs)的一種，其在肝癌組織中高表達(dá)[16]。對于uc.189在大腸癌中的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道，對其在大腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不明確。本研究采用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中uc.189高表達(dá)，約占86.2%(112/130), 而在18例患者中uc.189是正常表達(dá)和低表達(dá)，證實(shí)uc.189在130例大腸癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織中的表達(dá)量(P<0.05), 提示uc.189可能是一種新的腫瘤癌基因，極有可能參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究結(jié)果還表明，大腸癌患者uc.189表達(dá)越高，則腫瘤的分化程度越低、淋巴結(jié)容易發(fā)生轉(zhuǎn)移以及TNM分期越高，提示uc.189表達(dá)越高，患者的預(yù)后就越差, uc.189的表達(dá)在大腸癌的早期診斷和預(yù)后評估中具有一定的參考價(jià)值。

總之，本研究表明大腸癌中uc.189的表達(dá)高于相鄰的正常大腸組織，其高表達(dá)與大腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān), uc.189可能會(huì)作為大腸癌的一種新的腫瘤標(biāo)志物。