任開明

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 胸外科, 遼寧 沈陽, 110004)

在中國，肺癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤的首位，而肺鱗癌的發(fā)病率約占肺癌的1/3以上。多數(shù)肺鱗癌患者在初診時已是晚期，治療效果不佳[1]。目前，肺鱗癌主要的治療策略仍是手術(shù)切除輔助術(shù)后放射治療和化學(xué)藥物治療。近年來，針對肺鱗癌的突破性的精準(zhǔn)治療，尤其是靶向治療方面無明顯進展，研究[2]肺鱗癌發(fā)生進展的分子機制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點尤為重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指大于200 nt的RNA, 位于細胞核內(nèi)或胞漿中，不參與蛋白質(zhì)編碼功能，以RNA形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控下游的功能基因的表達水平，能夠參與細胞增殖、細胞周期、細胞分化、細胞凋亡以及細胞自噬性死亡等調(diào)節(jié)，進而發(fā)揮其生物學(xué)作用[3]。LncRNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1OT1)定位11p15.5, 屬于lncRNA。研究[4]發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸、直腸癌中存在表達及功能異常，而其在肺鱗癌中的功能和分子機制迄今尚無深入的研究。本研究擬檢測lncRNA KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中的表達，并研究KCNQ1OT1對肺鱗癌NCI-H266細胞增殖、遷移和侵襲等細胞生物學(xué)表型的調(diào)節(jié)作用[5], 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑

收集51例手術(shù)切除的肺鱗癌組織及相應(yīng)的距腫瘤5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本，標(biāo)本來源于2015年1月—2016年12 月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科手術(shù)患者，其中男28例，女23例。所有標(biāo)本經(jīng)病理鑒定均診斷為肺鱗癌。NCI-H266細胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。KCNQ1OT1 smart silencer (siRNA-KCNQ1OT1)由廣州銳博公司合成。Real-time PCR基因檢測分析試劑盒購自TaKaRa公司, PCR引物委托大連TaKaRa公司合成。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000為Invitrogen公司產(chǎn)品, MTT試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品, Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Real-time PCR: 待檢測組織標(biāo)本置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮用研杵研磨成粉末，加入TRIZOL, 提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。兩步法擴增KCNQ1OT1基因。KCNQ1OT1引物序列: Forward為5′-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT -3′, Reverse為5′- TGGGGTGAGGGATCTGAA -3′。以GAPDH 基因為內(nèi)參，根據(jù)實驗所獲Ct值對KCNQ1OT1進行相對定量分析，分析方法選用比較CT值法(2-ΔΔCT法)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染: 收獲處于對數(shù)生長期至60%～70%融合的NCI-H266細胞。應(yīng)用Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑，按說明操作分別將si-KCNQ1OT1及si-NC轉(zhuǎn)染NCI-H266細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞進行相應(yīng)檢測。

1.2.3 細胞增殖活力檢測: 空白對照組為未轉(zhuǎn)染的NCI-H266細胞; 陰性對照組為轉(zhuǎn)染si-NC的NCI-H266細胞; KCNQ1OT1組為轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1的NCI-H266細胞, MTT 法檢測細胞增殖活力。

1.2.4 細胞劃痕實驗: 將各組細胞接種到六孔板上，培養(yǎng)細胞匯合至80%左右時，用1 mL的移液槍頭在六孔板的中央迅速劃出一條直線，吸走培養(yǎng)液, PBS洗2次，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。連續(xù)觀察2 d, 查看劃痕的間距，并測量照相。

1.2.5 細胞侵襲實驗: 用無血清的opti-MEM培養(yǎng)基配Matrigel膠，均勻鋪在直徑為6.5 mm、孔徑為8.0 μm的Transwell小室內(nèi)面?zhèn)溆?。?4孔板，每孔含20%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，放上Transwell小室; 將各組細胞消化后加入不含血清的opti-MEM培養(yǎng)基分別均勻地鋪在上室內(nèi)培養(yǎng)。24 h后取出小室，清洗，上室面細胞擦涂凈; 將小室放入多聚甲醛固定液中，細胞固定，放入結(jié)晶紫染料中染色、清洗。在倒置鏡下觀察細胞個數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

每組實驗重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料統(tǒng)計結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組間差異比較采用t檢驗。多組間差異比較應(yīng)用單因素方差分析，再用LSD-t檢驗做兩兩比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Real-time PCR結(jié)果采用比較Ct值法分析進行相對定量，結(jié)果顯示KCNQ1OT1在肺鱗癌組織中呈顯著高表達，為癌旁正常組織中KCNQ1OT1表達量的346%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。KCNQ1OT1的表達與多種肺鱗癌的臨床病理參數(shù)相關(guān)，包括分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期。隨著肺鱗癌分化程度的降低、腫瘤體積的增大、TNM分期的增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，肺鱗癌中KCNQ1OT1的表達顯著增高(P<0.01); KCNQ1OT1表達與性別、年齡等其他臨床病理因素?zé)o相關(guān)性。見表1。

表1 KCNQ1OT表達與肺鱗癌患者臨床病理參數(shù)的

與同一參數(shù)另一亞項比較, **P<0.01。

與癌旁組織比較, ?P<0.05圖1 51例肺鱗癌組織與相應(yīng)癌旁正常肺組織中KCNQ1OT1的表達

2.2 沉默KCNQ1OT1基因?qū)CI-H266 細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

Real-time PCR檢測顯示，與對照組細胞相比, si-KCNQ1OT1的轉(zhuǎn)染能夠顯著下調(diào)NCI-H266細胞中KCNQ1OT1的表達(P<0.05), 沉默KCNQ1OT1能夠顯著抑制NCI-H266細胞的增殖活力、遷移能力、侵襲能力(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

目前，越來越多的證據(jù)支持lncRNA在多種生物學(xué)進程中發(fā)揮重要作用，并參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生，而且lncRNA參與了幾乎所有的生理和病理的細胞學(xué)特性，能夠通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、遷移和自噬等生物學(xué)表型[6-9]。某些lncRNA已被證實在多種腫瘤中存在表達和功能異常，而且可以作為腫瘤相關(guān)基因參與腫瘤的發(fā)生、惡性進展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等的調(diào)節(jié)[10-12]。KCNQ1OT1基因定位11p15.5, 屬于lncRNA。KCNQ1OT1的轉(zhuǎn)錄本是KCNQ1基因的反義鏈，是一個非拼接lncRNA。KCNQ1OT1與染色質(zhì)互相作用，通過表觀遺傳學(xué)機制調(diào)節(jié)多個靶基因的轉(zhuǎn)錄。KCNQ1OT1在腫瘤中的研究尚處于起步階段。有研究[13-14]報道, KCNQ1OT1在結(jié)直腸癌中存在顯著表達和功能異常。Wan J等[14]研究發(fā)現(xiàn), KCNQ1OT1中的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)多態(tài)性(rs35622507)與肝細胞癌的易感性相關(guān)。作者在lncRNA芯片篩查中發(fā)現(xiàn), KCNQ1OT1在5例肺鱗癌組織中表達顯著上調(diào)。而后，作者應(yīng)用實時定量PCR檢測了51例肺鱗癌組織，大樣本組織表達檢測證實了KCNQ1OT1在肺鱗癌中確實存在顯著的表達上調(diào)，這與李靜等[15]發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在89例非小細胞肺癌中的表達水平明顯增高相符。這初步證實KCNQ1OT1的表達異?？赡芘c肺鱗癌的發(fā)生相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn), KCNQ1OT1的表達與多種肺鱗癌的臨床病理參數(shù)相關(guān)。隨著肺鱗癌腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，肺鱗癌中KCNQ1OT1的表達明顯增高，進一步提示KCNQ1OT1可能在肺鱗癌的進展和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

Control表示空白對照組, si-NC表示轉(zhuǎn)染si-NC的NCI-H266細胞, si-KCNQ1OT1表示轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1的NCI-H266細胞。

A: 轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1顯著降低NCI-H266細胞中KCNQ1OT1表達，且與control、si-NC比較, *P<0.05;

B: MTT法檢測KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞的增殖活力，且與control、si-NC比較, *P<0.05;

C: KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞遷移能力; D: Transwell法檢測KCNQ1OT1表達沉默能抑制NCI-H266細胞的侵襲能力，且與control、si-NC比較, *P<0.05。

圖2 沉默KCNQ1OT1基因?qū)CI-H266細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

KCNQ1OT1在肺鱗癌中的功能尚不清楚，亦無相關(guān)文獻報道。作者應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默了肺鱗癌NCI-H266細胞中的KCNQ1OT1表達，并檢測其表達沉默對NCI-H266細胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制NCI-H266細胞的增殖活力以及遷移和侵襲能力。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制NCI-H266細胞的惡性生物學(xué)表型，證明KCNQ1OT1在肺鱗癌中發(fā)揮腫瘤促進作用，可能是肺鱗癌潛在的癌基因。

上述研究結(jié)果證實KCNQ1OT1的腫瘤促進作用，但其作用機制尚不清楚。近期有研究[16]報道, KCNQ1OT1能夠促進印記基因SLC22A18的表達，而SLC22A18基因在非小細胞肺癌中表達上調(diào)[17], 沉默其表達能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。據(jù)此作者推測, KCNQ1OT1可能在肺鱗癌中通過促進SLC22A18基因的表達，進而參與肺鱗癌細胞的惡性生物學(xué)表達的調(diào)控中，這需要進一步地深入研究。