王 鶴 彭 瑞 段文元 王紅艷, 姚曉英

先天性心臟病(CHD)在新生兒中發(fā)病率約0.9%[1, 2]。Wnt信號通路是調控心臟發(fā)育的重要信號通路之一，主要包括經典的Wnt/β-catenin信號通路、非經典的平面細胞極性(PCP)信號通路和Wnt/Ca2+信號通路。Dishevelled(DVL)蛋白在這3條Wnt信號通路中均發(fā)揮重要作用，是Wnt信號通路的一個中樞調節(jié)蛋白[3, 4]。Wnt信號通路的失調會導致早期心臟發(fā)育異?；駽HD[5-8]。

DACT1基因編碼的DACT1蛋白是Wnt信號通路的負調控因子。DACT1與DVL蛋白相互結合并在細胞內共定位，且與Axin、GSK-3、CKI、β-catenin組成復合體[4]。DACT1主要通過拮抗DVL2的功能發(fā)揮作用。DACT1蛋白可促進VHL與DVL2互作，加速DVL2泛素化，從而介導因蛋白聚集引發(fā)的自噬，降解DVL2[9]。過表達非洲爪蟾XDpr(DACT1同源基因)會抑制Dvl介導的經典和非經典Wnt信號通路，同時降低β-catenin應答基因及JNK活性；反之，抑制內源性XDpr基因表達，β-catenin和JNK信號通路都被激活[4]。在非洲爪蟾卵細胞中敲低XDpr后，亦有類似Wnt信號通路過度激活的表型，表現為脊索和頭部結構缺失[4]；敲除小鼠Dact1基因，PCP信號通路失調，純合突變小鼠幾乎在出生后1 d內全部死亡，泌尿生殖系統和消化道發(fā)育異常，部分新生小鼠還存在脊柱裂[10, 11]。人DACT1基因突變或表達失調可導致神經管畸形(NTD)、結腸癌或肝細胞癌[12-14]。但DACT1基因在心臟發(fā)育或CHD中的作用還未見報道。本研究擬篩選與CHD相關的DACT1基因突變，并對突變的生物學功能進行初步研究。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究方案和外周靜脈血的收集均經復旦大學生命科學學院倫理委員會批準[倫研批第(216)號]。受試者或其父母/監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 病例組來源 2008年8月至2011年1月收集的來自中國山東地區(qū)漢族人群的散發(fā)CHD的連續(xù)就診患兒，均通過超聲心動圖或手術明確診斷。排除：①綜合征型；②有CHD家族遺傳病史。

1.3 對照組來源 與病例組同時期同醫(yī)院的體檢健康兒童(山東地區(qū)的漢族人群)，經過聽診和影像學檢查排除了患有CHD的兒童，同時排除有CHD家族史的兒童。

1.4DACT1基因測序和生物信息學分析 提取外周靜脈血基因組DNA(德國Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒)。靶向DACT1基因編碼區(qū)進行測序，由江蘇基譜生物科技發(fā)展有限公司完成(美國illumina公司Hiseq 2000測序儀)。以hg19/GRCh37(NM_016651)為參考序列，使用SNP nexus工具對單核苷酸變異(SNV)進行注釋[15]。將獲得的所有突變與數據庫dbSNP(version137)和千人基因組進行比對，排除已有研究報道的“已知(known)”位點，得到無報道的“新發(fā)現(novel)”位點，或未見病例研究的稀有突變位點，并將病例組與對照組SNV進行比對，得到病例特異性的新發(fā)現或稀有DACT1錯義突變位點，進一步進行Sanger法驗證，引物見表1。用SIFT和PolyPhen-2軟件分析錯義突變位點的有害性，并用GEPR和在線分析軟件Clustal Omega進行保守性分析[16, 17]。

1.5 突變相關的生物學功能分析

1.5.1 質粒構建 提取HEK293T細胞(中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)的總RNA [天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒]，反轉錄[天根生化科技(北京)有限公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒]后PCR擴增得到人DACT1基因的cDNA。通過酶切、連接反應，將人DACT1編碼區(qū)序列連接到pcDNA3.1(-)B-myc/his載體(美國Invitrogen公司)上，獲得野生型DACT1的表達質粒。在該表達質粒的基礎上，設計引物，利用KOD-plus酶(日本Toyobo公司)進行單點突變，從而得到與DACT1錯義突變位點一致的點突變質粒。利用同樣的方法，將人DVL2基因編碼區(qū)克隆至載體pCMV6-HA (美國Origene公司)。所有質粒都經過測序驗證。PCR反應的引物利用在線引物設計軟件Primer3(http://primer3.ut.ee)設計，引物序列見表1。

表1 引物序列

注 測序引物1和2：突變位點驗證的測序引物；DACT1和DVL2：構建DACT1和DVL2表達質粒的引物；C1486T、C1598A、G1659C和T1891A為DACT1定點突變引物

1.5.2 蛋白質免疫印跡實驗 將HEK293T細胞均勻鋪于6孔板，待細胞密度達70%左右時用Lipofectamine 2000[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]轉染。為檢測DACT1突變型的蛋白表達水平，將野生型和突變型DACT1表達質粒分別與pCMV6-AC-GFP質粒(美國Origene公司)共轉，GFP作為內參。為檢測DACT1突變型蛋白的功能，將野生型和突變型DACT1表達質粒分別與DVL2表達質粒和pCMV6-AC-GFP質粒共轉。轉染24 h后，收取細胞，裂解后提取蛋白質，用于蛋白質免疫印跡實驗，用ECL顯影液(上海天能科技有限公司)及化學發(fā)光成像系統(上海天能科技有限公司)進行顯影和圖像紀錄。實驗中所用抗體包括His標簽抗體(美國Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、HA標簽抗體(美國Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、GFP抗體(美國Origene公司，1∶10 000稀釋)、羊抗鼠二抗[艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司，1∶10 000稀釋]。

1.5.3 雙熒光素酶報告基因實驗 經典Wnt信號通路被活化時β-catenin入核，與轉錄因子TCF/LEF結合形成復合物，促進下游調控基因的轉錄。質粒Topflash(上海吉滿生物科技公司)的熒光素酶報告基因的啟動子區(qū)包含多個TCF/LEF結合位點，因此Topflash質粒的熒光素酶的強弱直接反應了經典Wnt信號活性。本研究將野生型和突變型DACT1表達質粒分別與報告基因質粒Topflash共轉染HEK293T細胞，檢測DACT1對經典Wnt信號通路的調控作用。

PCP信號通路被活化時，可以通過JNK激活下游靶蛋白c-Jun。檢測PCP信號通路活性時常用的報告基因體系[PathDetect in Vivo Signal Transduction Pathway trans-Reporting Systems (美國Agilent Technologies公司)]包含pFA2-cJun和pFR-luc 2個質粒。表達質粒pFA2-cJun表達的c-Jun被PCP 信號激活時啟動報告質粒pFR-luc的熒光素酶報告基因的表達。本研究將野生型和突變型DACT1表達質粒分別與pFA2-cJun、pFR-luc共轉染HEK293T細胞，觀察DACT1突變對PCP 信號通路的影響。

具體操作：將HEK293T細胞均勻地鋪在24孔板中，待細胞密度達70%左右時用 Lipofectamine 2000 [賽默飛世爾科技(中國)有限公司]轉染，編碼海蜃(renilla)熒光素酶的內參報告質粒pRL-TK(美國Promega公司)被共轉染用于校正轉染效率。轉染24 h后，收取細胞，裂解、離心后，檢測上清液中的螢火蟲(firely)和renilla熒光素酶活性(美國Promega公司的雙熒光素酶報告實驗系統)。

1.6 統計學方法 蛋白質免疫印跡實驗結果利用ImageJ軟件進行灰度分析，灰度分析結果以及雙熒光素酶報告基因實驗結果都采用雙尾非配對t檢驗分析顯著性，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 病例組404例，年齡(2.9±2.7)歲；對照組213名，年齡(7.1±3.7)歲；病例組和對照組的男女比例分別為1.2∶1和1∶1。病例組包括圓錐動脈干畸形138例(33.5%)、隔膜缺損138例(33.5%)、右室流出道梗阻44例(10.7 %)、房室間隔缺損21例(5.1%)、動脈導管未閉17例(4.1%)、左室流出道梗阻17例(4.1%)、肺靜脈回流異常12例(2.9%)，復合型心臟異常10例(2.4%)、心臟異位3例(0.7%)、其他4例(1.0%)。

2.2DACT1基因測序結果分析 通過對兩組進行DACT1基因的編碼區(qū)、5’UTR和3’UTR區(qū)域的靶向深度測序分析,在3例CHD中篩選到4個DACT1基因編碼區(qū)的新發(fā)現或稀有的錯義突變，為c.1486C>T (p.S441L)、 c.1598C>A (p.S478R)、c.1659G>C (p.E499Q)和c.1891T>A (p.M576K)，分別簡稱為DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。其中DACT1S441L和DACT1S478R來自于同一患兒，分別位于2條不同染色體。DACT1S441L和DACT1E499Q2個錯義突變在ExAC數據庫中沒有報道，為本研究發(fā)現的CHD病例特有的新突變；DACT1S478R和DACT1M576K在ExAC數據庫有報道，其最小等位基因頻率(MAF)分別是8.4×10-6和8.9×10-6，為稀有錯義突變 (表2)。對攜帶這4個突變的CHD病例的DNA樣品進行了Sanger測序驗證，均為雜合突變(圖1A)。

2.3DACT1錯義突變氨基酸位點的生物信息學分析 圖1B顯示，用GERP和Clusstal Omega分析軟件對4個突變的氨基酸位點進行保守性分析，DACT1S478R和DACT1E499Q在人、黑猩猩、牛、大鼠、小鼠和羊6個物種中保守性很高，位點DACT1S441L和DACT1M576K無很強保守性。表2顯示，用SIFT和PolyPhen-2對突變位點的有害性進行評估，DACT1S441L被SIFT評價為有害突變(0.01)；DACT1E499Q被PolyPhen-2評價為可能有害(0.978)，DACT1S478R和DACT1M576K被SIFT和PolyPhen-2預測為無有害性。

2.4DACT1突變對DACT1蛋白表達和功能的影響 通過對DACT1WT進行單點突變，分別獲得與4個體內突變位點一致的點突變質粒DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。

2.4.1 突變對DACT1蛋白表達水平的影響 在HEK293T細胞中分別表達野生型和突變型DACT1基因并共轉pCMV6-AC-GFP作為內參，圖2A蛋白質免疫印跡實驗顯示，4種突變型對DACT1蛋白的表達水平均無明顯影響。

表2 DACT1突變位點信息和生物信息學分析結果

圖1DACT1基因CHD病例中特有的4個錯義突變位點的保守性分析

注 A: c.1486 C>T(p.S441L)，c.1659G>C(p.E499Q)，c.1598C>A(p.S478R)和c.1891T>A(p.M576K)突變的Sanger測序結果圖，黑色箭頭位置為發(fā)生突變的位置。 B: 6種脊椎動物中DACT1蛋白部分氨基酸順序排列，黑框顯示突變氨基酸的位置

2.4.2DACT1突變對DVL2蛋白表達的影響 在HEK293T細胞中，將野生型和突變DACT1分別與DVL2共表達，同時共轉GFP作為內參，用蛋白質免疫印跡法檢測外源DVL2蛋白水平，并利用灰度分析進行計算。圖2B顯示，與空載的對照組相比，野生型DACT1可以顯著下調共表達的DVL2蛋白水平(P<0.05)。與野生型DACT1相比較，DACT1E499Q對DVL2蛋白的下調作用顯著減弱(P<0.05)，其他3個突變型的DACT1蛋白與野生型相比對DVL2蛋白的作用差異無統計學意義。

2.5DACT1突變對經典Wnt信號通路及PCP信號通路的影響 圖2C顯示，與對照比較，野生型DACT1顯著下調經典Wnt信號通路(P<0.001)和PCP信號通路(P<0.001)的活性；與野生型DACT1相比，DACT1E499Q顯著降低了對經典Wnt信號通路(P<0.01)和PCP信號通路(P<0.01)的抑制作用，其他3種突變型DACT1與野生型DACT1相比對2種信號通路的作用差異無統計學意義。

圖2DACT1點突變對DACT1、DVL2蛋白表達以及對經典Wnt信號通路和PCP信號通路的影響

注 實驗采用HEK293T細胞。A: DACT1蛋白表達；B：DVL2蛋白表達；C：對經典Wnt信號通路的影響；D：對PCP信號通路的影響。1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，ns：差異無統計學意義

3 討論

Wnt信號通路在胚胎發(fā)育中起重要作用。既往已有多項研究探討了Wnt信號通路在哺乳動物心臟形成和心肌細胞分化中的作用，Wnt信號通路的精確調控對于哺乳動物的心臟發(fā)育過程有重要意義[18]。DVL2在Wnt信號通路的調節(jié)中處于中樞位置，在β-catenin依賴的經典Wnt信號通路和β-catenin不依賴的非經典Wnt信號通路中都發(fā)揮重要作用[3]。Dvl2敲除的小鼠實驗結果顯示Dvl2為心臟錐體動脈發(fā)育中的關鍵介質[6]。DACT1可通過與DVL2互作，加速其降解，以此調節(jié)Wnt信號通路。雖然DACT1對Wnt信號通路的調節(jié)作用已有研究，但對DACT1在CHD發(fā)生的過程中是否有貢獻作用，尚無相關報道。

本研究中通過對404例散發(fā)CHD病例和213名健康對照的DACT1基因進行靶向測序，篩選出2個病例特有的新雜合錯義突變DACT1S441L和DACT1E499Q，以及2個病例特有的稀有雜合錯義突變DACT1S478R和DACT1M576K。蛋白質免疫印跡實驗及雙熒光素酶報告基因實驗的結果表明，突變型DACT1E499Q對DVL2蛋白的下調水平減弱，并顯示出對經典Wnt信號通路和PCP信號通路的抑制作用的部分喪失。表明DACT1E499Q突變可能是散發(fā)CHD的風險因素。

散發(fā)的CHD是性狀復雜的疾病，通常是許多基因或者1個基因的多個等位基因和環(huán)境共同作用導致最終的疾病表型。通常有兩種假說用于解釋CHD，分別為常見疾病/常見突變和常見疾病/稀有突變。前者認為，少數基因座位上的常見等位基因相互作用會導致疾病發(fā)生，而后者認為許多基因座上的罕見等位基因可以單獨引起疾病[19]。已有研究表明，這兩種假設都是正確的，主要取決于研究的疾病和基因的不同[20]。 因此，本研究在病例中鑒定出的錯義突變位點DACT1S441L、DACT1S478R和DACT1M576K，未觀察到對DVL2蛋白水平和功能的影響，原因之一可能為，在病例體內復雜的環(huán)境中，這些突變位點與其他基因的突變協同作用而共同促進CHD的發(fā)生。為了驗證本文結論，可擴大測序樣本量，并用合適的動物模型行體內實驗。

致謝

本研究工作得到了復旦大學現代人類學教育部重點實驗室和復旦大學遺傳工程國家重點實驗室的技術支持。