王 鶴 彭 瑞 段文元 王紅艷, 姚曉英

先天性心臟病(CHD)在新生兒中發(fā)病率約0.9%[1, 2]。Wnt信號(hào)通路是調(diào)控心臟發(fā)育的重要信號(hào)通路之一，主要包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路、非經(jīng)典的平面細(xì)胞極性(PCP)信號(hào)通路和Wnt/Ca2+信號(hào)通路。Dishevelled(DVL)蛋白在這3條Wnt信號(hào)通路中均發(fā)揮重要作用，是Wnt信號(hào)通路的一個(gè)中樞調(diào)節(jié)蛋白[3, 4]。Wnt信號(hào)通路的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致早期心臟發(fā)育異?；駽HD[5-8]。

DACT1基因編碼的DACT1蛋白是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子。DACT1與DVL蛋白相互結(jié)合并在細(xì)胞內(nèi)共定位，且與Axin、GSK-3、CKI、β-catenin組成復(fù)合體[4]。DACT1主要通過(guò)拮抗DVL2的功能發(fā)揮作用。DACT1蛋白可促進(jìn)VHL與DVL2互作，加速DVL2泛素化，從而介導(dǎo)因蛋白聚集引發(fā)的自噬，降解DVL2[9]。過(guò)表達(dá)非洲爪蟾XDpr(DACT1同源基因)會(huì)抑制Dvl介導(dǎo)的經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，同時(shí)降低β-catenin應(yīng)答基因及JNK活性；反之，抑制內(nèi)源性XDpr基因表達(dá)，β-catenin和JNK信號(hào)通路都被激活[4]。在非洲爪蟾卵細(xì)胞中敲低XDpr后，亦有類(lèi)似Wnt信號(hào)通路過(guò)度激活的表型，表現(xiàn)為脊索和頭部結(jié)構(gòu)缺失[4]；敲除小鼠Dact1基因，PCP信號(hào)通路失調(diào)，純合突變小鼠幾乎在出生后1 d內(nèi)全部死亡，泌尿生殖系統(tǒng)和消化道發(fā)育異常，部分新生小鼠還存在脊柱裂[10, 11]。人DACT1基因突變或表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)管畸形(NTD)、結(jié)腸癌或肝細(xì)胞癌[12-14]。但DACT1基因在心臟發(fā)育或CHD中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬篩選與CHD相關(guān)的DACT1基因突變，并對(duì)突變的生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究方案和外周靜脈血的收集均經(jīng)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫研批第(216)號(hào)]。受試者或其父母/監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例組來(lái)源 2008年8月至2011年1月收集的來(lái)自中國(guó)山東地區(qū)漢族人群的散發(fā)CHD的連續(xù)就診患兒，均通過(guò)超聲心動(dòng)圖或手術(shù)明確診斷。排除：①綜合征型；②有CHD家族遺傳病史。

1.3 對(duì)照組來(lái)源 與病例組同時(shí)期同醫(yī)院的體檢健康兒童(山東地區(qū)的漢族人群)，經(jīng)過(guò)聽(tīng)診和影像學(xué)檢查排除了患有CHD的兒童，同時(shí)排除有CHD家族史的兒童。

1.4DACT1基因測(cè)序和生物信息學(xué)分析 提取外周靜脈血基因組DNA(德國(guó)Qiagen公司血液基因組DNA提取試劑盒)。靶向DACT1基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，由江蘇基譜生物科技發(fā)展有限公司完成(美國(guó)illumina公司Hiseq 2000測(cè)序儀)。以hg19/GRCh37(NM_016651)為參考序列，使用SNP nexus工具對(duì)單核苷酸變異(SNV)進(jìn)行注釋[15]。將獲得的所有突變與數(shù)據(jù)庫(kù)dbSNP(version137)和千人基因組進(jìn)行比對(duì)，排除已有研究報(bào)道的“已知(known)”位點(diǎn)，得到無(wú)報(bào)道的“新發(fā)現(xiàn)(novel)”位點(diǎn)，或未見(jiàn)病例研究的稀有突變位點(diǎn)，并將病例組與對(duì)照組SNV進(jìn)行比對(duì)，得到病例特異性的新發(fā)現(xiàn)或稀有DACT1錯(cuò)義突變位點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行Sanger法驗(yàn)證，引物見(jiàn)表1。用SIFT和PolyPhen-2軟件分析錯(cuò)義突變位點(diǎn)的有害性，并用GEPR和在線分析軟件Clustal Omega進(jìn)行保守性分析[16, 17]。

1.5 突變相關(guān)的生物學(xué)功能分析

1.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建 提取HEK293T細(xì)胞(中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))的總RNA [天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒]，反轉(zhuǎn)錄[天根生化科技(北京)有限公司FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒]后PCR擴(kuò)增得到人DACT1基因的cDNA。通過(guò)酶切、連接反應(yīng)，將人DACT1編碼區(qū)序列連接到pcDNA3.1(-)B-myc/his載體(美國(guó)Invitrogen公司)上，獲得野生型DACT1的表達(dá)質(zhì)粒。在該表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物，利用KOD-plus酶(日本Toyobo公司)進(jìn)行單點(diǎn)突變，從而得到與DACT1錯(cuò)義突變位點(diǎn)一致的點(diǎn)突變質(zhì)粒。利用同樣的方法，將人DVL2基因編碼區(qū)克隆至載體pCMV6-HA (美國(guó)Origene公司)。所有質(zhì)粒都經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。PCR反應(yīng)的引物利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer3(http://primer3.ut.ee)設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

注 測(cè)序引物1和2：突變位點(diǎn)驗(yàn)證的測(cè)序引物；DACT1和DVL2：構(gòu)建DACT1和DVL2表達(dá)質(zhì)粒的引物；C1486T、C1598A、G1659C和T1891A為DACT1定點(diǎn)突變引物

1.5.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將HEK293T細(xì)胞均勻鋪于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)用Lipofectamine 2000[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]轉(zhuǎn)染。為檢測(cè)DACT1突變型的蛋白表達(dá)水平，將野生型和突變型DACT1表達(dá)質(zhì)粒分別與pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒(美國(guó)Origene公司)共轉(zhuǎn)，GFP作為內(nèi)參。為檢測(cè)DACT1突變型蛋白的功能，將野生型和突變型DACT1表達(dá)質(zhì)粒分別與DVL2表達(dá)質(zhì)粒和pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染24 h后，收取細(xì)胞，裂解后提取蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，用ECL顯影液(上海天能科技有限公司)及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)進(jìn)行顯影和圖像紀(jì)錄。實(shí)驗(yàn)中所用抗體包括His標(biāo)簽抗體(美國(guó)Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、HA標(biāo)簽抗體(美國(guó)Proteintech公司，1∶3 000稀釋)、GFP抗體(美國(guó)Origene公司，1∶10 000稀釋)、羊抗鼠二抗[艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司，1∶10 000稀釋]。

1.5.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路被活化時(shí)β-catenin入核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒Topflash(上海吉滿(mǎn)生物科技公司)的熒光素酶報(bào)告基因的啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)TCF/LEF結(jié)合位點(diǎn)，因此Topflash質(zhì)粒的熒光素酶的強(qiáng)弱直接反應(yīng)了經(jīng)典Wnt信號(hào)活性。本研究將野生型和突變型DACT1表達(dá)質(zhì)粒分別與報(bào)告基因質(zhì)粒Topflash共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，檢測(cè)DACT1對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用。

PCP信號(hào)通路被活化時(shí)，可以通過(guò)JNK激活下游靶蛋白c-Jun。檢測(cè)PCP信號(hào)通路活性時(shí)常用的報(bào)告基因體系[PathDetect in Vivo Signal Transduction Pathway trans-Reporting Systems (美國(guó)Agilent Technologies公司)]包含pFA2-cJun和pFR-luc 2個(gè)質(zhì)粒。表達(dá)質(zhì)粒pFA2-cJun表達(dá)的c-Jun被PCP 信號(hào)激活時(shí)啟動(dòng)報(bào)告質(zhì)粒pFR-luc的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。本研究將野生型和突變型DACT1表達(dá)質(zhì)粒分別與pFA2-cJun、pFR-luc共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，觀察DACT1突變對(duì)PCP 信號(hào)通路的影響。

具體操作：將HEK293T細(xì)胞均勻地鋪在24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)用 Lipofectamine 2000 [賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]轉(zhuǎn)染，編碼海蜃(renilla)熒光素酶的內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK(美國(guó)Promega公司)被共轉(zhuǎn)染用于校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24 h后，收取細(xì)胞，裂解、離心后，檢測(cè)上清液中的螢火蟲(chóng)(firely)和renilla熒光素酶活性(美國(guó)Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)系統(tǒng))。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，灰度分析結(jié)果以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果都采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)分析顯著性，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 病例組404例，年齡(2.9±2.7)歲；對(duì)照組213名，年齡(7.1±3.7)歲；病例組和對(duì)照組的男女比例分別為1.2∶1和1∶1。病例組包括圓錐動(dòng)脈干畸形138例(33.5%)、隔膜缺損138例(33.5%)、右室流出道梗阻44例(10.7 %)、房室間隔缺損21例(5.1%)、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉17例(4.1%)、左室流出道梗阻17例(4.1%)、肺靜脈回流異常12例(2.9%)，復(fù)合型心臟異常10例(2.4%)、心臟異位3例(0.7%)、其他4例(1.0%)。

2.2DACT1基因測(cè)序結(jié)果分析 通過(guò)對(duì)兩組進(jìn)行DACT1基因的編碼區(qū)、5’UTR和3’UTR區(qū)域的靶向深度測(cè)序分析,在3例CHD中篩選到4個(gè)DACT1基因編碼區(qū)的新發(fā)現(xiàn)或稀有的錯(cuò)義突變，為c.1486C>T (p.S441L)、 c.1598C>A (p.S478R)、c.1659G>C (p.E499Q)和c.1891T>A (p.M576K)，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。其中DACT1S441L和DACT1S478R來(lái)自于同一患兒，分別位于2條不同染色體。DACT1S441L和DACT1E499Q2個(gè)錯(cuò)義突變?cè)贓xAC數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有報(bào)道，為本研究發(fā)現(xiàn)的CHD病例特有的新突變；DACT1S478R和DACT1M576K在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)有報(bào)道，其最小等位基因頻率(MAF)分別是8.4×10-6和8.9×10-6，為稀有錯(cuò)義突變 (表2)。對(duì)攜帶這4個(gè)突變的CHD病例的DNA樣品進(jìn)行了Sanger測(cè)序驗(yàn)證，均為雜合突變(圖1A)。

2.3DACT1錯(cuò)義突變氨基酸位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析 圖1B顯示，用GERP和Clusstal Omega分析軟件對(duì)4個(gè)突變的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析，DACT1S478R和DACT1E499Q在人、黑猩猩、牛、大鼠、小鼠和羊6個(gè)物種中保守性很高，位點(diǎn)DACT1S441L和DACT1M576K無(wú)很強(qiáng)保守性。表2顯示，用SIFT和PolyPhen-2對(duì)突變位點(diǎn)的有害性進(jìn)行評(píng)估，DACT1S441L被SIFT評(píng)價(jià)為有害突變(0.01)；DACT1E499Q被PolyPhen-2評(píng)價(jià)為可能有害(0.978)，DACT1S478R和DACT1M576K被SIFT和PolyPhen-2預(yù)測(cè)為無(wú)有害性。

2.4DACT1突變對(duì)DACT1蛋白表達(dá)和功能的影響 通過(guò)對(duì)DACT1WT進(jìn)行單點(diǎn)突變，分別獲得與4個(gè)體內(nèi)突變位點(diǎn)一致的點(diǎn)突變質(zhì)粒DACT1S441L、DACT1S478R、DACT1E499Q和DACT1M576K。

2.4.1 突變對(duì)DACT1蛋白表達(dá)水平的影響 在HEK293T細(xì)胞中分別表達(dá)野生型和突變型DACT1基因并共轉(zhuǎn)pCMV6-AC-GFP作為內(nèi)參，圖2A蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，4種突變型對(duì)DACT1蛋白的表達(dá)水平均無(wú)明顯影響。

表2 DACT1突變位點(diǎn)信息和生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖1DACT1基因CHD病例中特有的4個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)的保守性分析

注 A: c.1486 C>T(p.S441L)，c.1659G>C(p.E499Q)，c.1598C>A(p.S478R)和c.1891T>A(p.M576K)突變的Sanger測(cè)序結(jié)果圖，黑色箭頭位置為發(fā)生突變的位置。 B: 6種脊椎動(dòng)物中DACT1蛋白部分氨基酸順序排列，黑框顯示突變氨基酸的位置

2.4.2DACT1突變對(duì)DVL2蛋白表達(dá)的影響 在HEK293T細(xì)胞中，將野生型和突變DACT1分別與DVL2共表達(dá)，同時(shí)共轉(zhuǎn)GFP作為內(nèi)參，用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)外源DVL2蛋白水平，并利用灰度分析進(jìn)行計(jì)算。圖2B顯示，與空載的對(duì)照組相比，野生型DACT1可以顯著下調(diào)共表達(dá)的DVL2蛋白水平(P<0.05)。與野生型DACT1相比較，DACT1E499Q對(duì)DVL2蛋白的下調(diào)作用顯著減弱(P<0.05)，其他3個(gè)突變型的DACT1蛋白與野生型相比對(duì)DVL2蛋白的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5DACT1突變對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路及PCP信號(hào)通路的影響 圖2C顯示，與對(duì)照比較，野生型DACT1顯著下調(diào)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(P<0.001)和PCP信號(hào)通路(P<0.001)的活性；與野生型DACT1相比，DACT1E499Q顯著降低了對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(P<0.01)和PCP信號(hào)通路(P<0.01)的抑制作用，其他3種突變型DACT1與野生型DACT1相比對(duì)2種信號(hào)通路的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2DACT1點(diǎn)突變對(duì)DACT1、DVL2蛋白表達(dá)以及對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和PCP信號(hào)通路的影響

注 實(shí)驗(yàn)采用HEK293T細(xì)胞。A: DACT1蛋白表達(dá)；B：DVL2蛋白表達(dá)；C：對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的影響；D：對(duì)PCP信號(hào)通路的影響。1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，ns：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中起重要作用。既往已有多項(xiàng)研究探討了Wnt信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物心臟形成和心肌細(xì)胞分化中的作用，Wnt信號(hào)通路的精確調(diào)控對(duì)于哺乳動(dòng)物的心臟發(fā)育過(guò)程有重要意義[18]。DVL2在Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中處于中樞位置，在β-catenin依賴(lài)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和β-catenin不依賴(lài)的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中都發(fā)揮重要作用[3]。Dvl2敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Dvl2為心臟錐體動(dòng)脈發(fā)育中的關(guān)鍵介質(zhì)[6]。DACT1可通過(guò)與DVL2互作，加速其降解，以此調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路。雖然DACT1對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用已有研究，但對(duì)DACT1在CHD發(fā)生的過(guò)程中是否有貢獻(xiàn)作用，尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究中通過(guò)對(duì)404例散發(fā)CHD病例和213名健康對(duì)照的DACT1基因進(jìn)行靶向測(cè)序，篩選出2個(gè)病例特有的新雜合錯(cuò)義突變DACT1S441L和DACT1E499Q，以及2個(gè)病例特有的稀有雜合錯(cuò)義突變DACT1S478R和DACT1M576K。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果表明，突變型DACT1E499Q對(duì)DVL2蛋白的下調(diào)水平減弱，并顯示出對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和PCP信號(hào)通路的抑制作用的部分喪失。表明DACT1E499Q突變可能是散發(fā)CHD的風(fēng)險(xiǎn)因素。

散發(fā)的CHD是性狀復(fù)雜的疾病，通常是許多基因或者1個(gè)基因的多個(gè)等位基因和環(huán)境共同作用導(dǎo)致最終的疾病表型。通常有兩種假說(shuō)用于解釋CHD，分別為常見(jiàn)疾病/常見(jiàn)突變和常見(jiàn)疾病/稀有突變。前者認(rèn)為，少數(shù)基因座位上的常見(jiàn)等位基因相互作用會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生，而后者認(rèn)為許多基因座上的罕見(jiàn)等位基因可以單獨(dú)引起疾病[19]。已有研究表明，這兩種假設(shè)都是正確的，主要取決于研究的疾病和基因的不同[20]。 因此，本研究在病例中鑒定出的錯(cuò)義突變位點(diǎn)DACT1S441L、DACT1S478R和DACT1M576K，未觀察到對(duì)DVL2蛋白水平和功能的影響，原因之一可能為，在病例體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境中，這些突變位點(diǎn)與其他基因的突變協(xié)同作用而共同促進(jìn)CHD的發(fā)生。為了驗(yàn)證本文結(jié)論，可擴(kuò)大測(cè)序樣本量，并用合適的動(dòng)物模型行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

致謝

本研究工作得到了復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類(lèi)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)支持。