朱曉娜 夏 宇 楊 軍

1 病例資料

男，14月齡，因“反復(fù)感染1年余，腹脹伴間斷發(fā)熱3個(gè)月”于2018年2月就診于深圳市兒童醫(yī)院(我院)風(fēng)濕免疫科。

患兒生后2 d出現(xiàn)呼吸道感染，4月齡腋窩膿腫，5月齡重癥肺炎伴巨細(xì)胞病毒(CMV)感染，間斷給予IVIG治療，仍出現(xiàn)多次下呼吸道感染，12月齡馬爾尼菲青霉菌敗血癥，13月齡反復(fù)腹脹、輪狀病毒腹瀉，伴生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及肝脾腫大。曾予呼吸機(jī)輔助呼吸，利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、美羅培南、頭孢哌酮舒巴坦、更昔洛韋、伊曲康唑和伏立康唑等抗感染。

既往史：無(wú)乙肝、結(jié)核等傳染病史及接觸史，“青霉素”過(guò)敏史，無(wú)食物過(guò)敏史，既往曾行膿腫切開引流術(shù)，無(wú)外傷史，無(wú)異物吸入史。

個(gè)人史：患兒系G3P2，足月順產(chǎn)，出生體重3 350 g，生后母乳喂養(yǎng)至12月齡，6月齡添加輔食，現(xiàn)普食。2月齡會(huì)抬頭，4月齡會(huì)坐，11月齡會(huì)站，13月齡尚不能獨(dú)走、精細(xì)抓物和叫爸爸媽媽。未按時(shí)預(yù)防接種。

家族史：父母體健，否認(rèn)家族遺傳病史，父母非近親婚配。

體格檢查：T 37℃，HR 115·min-1，R 24·min-1，體重9.5 kg(P3～P10)，身高73 cm(

圖1 患兒皮膚黃染及腹壁靜脈曲張

輔助檢查：血常規(guī)WBC (9.30～13.16)×109·L-1，N (1.29～5.34)×109·L-1，L (3.62～4.24)×109·L-1，PLT (115～188)×109·L-1，Hb 95～100 g·L-1，ESR 57 mm·h-1，PCT 0.2～27.4 ng·mL-1。體液免疫指標(biāo)IgG 0.37 g·L-1，IgA 0.04 g·L-1，IgM 1.21 g·L-1，IgE 0.1 IU·mL-1。淋巴細(xì)胞免疫分析CD3+80.9%，CD4+54.9%，CD8+23.2%，CD19+15.4%，CD16+CD56+1.96%，總T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)2 440·μL-1，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)1 751·μL-1，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)740·μL-1，B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)438·μL-1，NK細(xì)胞計(jì)數(shù)56·μL-1。肝功能AST 98～209 IU·L-1，ALT 138～414 IU·L-1，TBIL 29.6～92.1 μmol·L-1，DBIL 21.0～69.1 μmol·L-1。甲狀腺功能FT33.3 pmol·L-1，T30.8 nmol·L-1，F(xiàn)T47.3 pmol·L-1，T499.9 nmol·L-1，甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)49.8 U·mL-1，甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)81.1 IU·mL-1。直接Coombs試驗(yàn)可疑，間接Coombs試驗(yàn)陰性。血培養(yǎng)(馬爾尼菲青霉菌+)；真菌D-葡聚糖420.4 pg·mL-1；血CMV DNA 5.1×102拷貝·mL-1；糞便沙門氏菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性。骨髓細(xì)胞學(xué)檢測(cè)示，骨髓增生明顯活躍，成熟階段中性粒系比例減低，嗜酸性粒細(xì)胞增多癥(中度)。胸部CT示，兩肺散在多發(fā)間質(zhì)性病變，兩側(cè)少量胸腔積液(圖2A)。上消化道超聲：食管下段及胃底靜脈迂曲、擴(kuò)張。上消化道CT平掃+增強(qiáng)+三維重建：肝臟增大，格林生系統(tǒng)增寬，門靜脈較細(xì)小，第一肝門區(qū)分支增多、迂曲，考慮肝門靜脈海綿樣變性，脾臟體積增大，肝門區(qū)及腹膜后軟組織樣密度影(圖2B)。

圖2 患兒胸部、腹部CT

免疫分型：表2顯示，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]的方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞精細(xì)分型(BD公司，美國(guó))。流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示，T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量正常，記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞明顯減少(均為0)。

經(jīng)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，對(duì)患兒及其父母進(jìn)行應(yīng)用免疫整體捕獲方案(邁基諾，北京)進(jìn)行全外顯子測(cè)序，依據(jù)1000 Genomes Project，Exome Variant Server(EVS)及Exome Aggregation Consortium(ExAc)數(shù)據(jù)庫(kù)，濾除人群中突變頻率>1%的變異，去除每個(gè)外顯子及上下游各50 bp內(nèi)含子變異、同義變異(除外位于剪切位點(diǎn)的變異)等，同時(shí)使用SIFT、PolyPhen等軟件對(duì)篩選出的突變對(duì)蛋白功能的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)美國(guó)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)制定的指南篩選出可能致病的突變[3]。結(jié)果顯示，全外顯子測(cè)序點(diǎn)突變分析未見可疑致病突變位點(diǎn)。

拷貝數(shù)變異分析：采用cnvkit軟件，利用同一pool捕獲的樣本作對(duì)照進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)target區(qū)域和非target區(qū)域的reads深度，然后在樣本內(nèi)對(duì)深度進(jìn)行均一化和矯正，和對(duì)照集進(jìn)行比較計(jì)算，得到拷貝數(shù)的信息，用循環(huán)二元分割算法(CBS)對(duì)區(qū)域進(jìn)行分割。通過(guò)Reads數(shù)分析發(fā)現(xiàn)患兒CD40LG片段疑似缺失(圖3)。

CD40LG基因外顯子熒光定量PCR：提取患兒及其父母基因組DNA，根據(jù)CD40LG基因的不同外顯子設(shè)計(jì)引物(表2)，應(yīng)用ROCHE480PCR儀，20 μL體系擴(kuò)增，記錄Ct值，采用文獻(xiàn)[4]報(bào)道的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；純浩骄鵆t值為35，CD40LG基因1～5號(hào)外顯子大片段缺失。其父親和母親平均Ct值分別為26.1和25.8，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖3 患者X染色體(Xq25-28)二代測(cè)序reads分析結(jié)果

圖4 患者家系CD40LG基因各外顯子qPCR擴(kuò)增結(jié)果

注 P：患兒；PF：患兒父親；PM：患兒母親；E1-E5：CD40LG基因DNA1至5號(hào)外顯子

CD40LG基因cDNA凝膠電泳：使用RNAiso Blood試劑盒(Takara公司，日本)提取RNA，應(yīng)用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司，日本)完成患兒及其父母和正常對(duì)照的RNA的反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)上下游引物(表2)，反應(yīng)體系為25 μL，退火溫度為60℃。擴(kuò)增完成后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳?；純篊D40LG基因CDS序列cDNA擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物，其父母cDNA擴(kuò)增有產(chǎn)物(圖5)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD40L的表達(dá)情況：采集患兒、患兒母親和健康對(duì)照者靜脈血0.2 mL，與RPMI-1640(Thermo Fisher公司，美國(guó))培養(yǎng)基混勻，標(biāo)記為未刺激管；另取抗凝血0.2 mL，與RPMI-1640培養(yǎng)基、PMA(Sigma公司，美國(guó)，1 ng·μL-1)、離子霉素(Sigma公司，美國(guó)，50 ng·μL-1)作刺激劑，充分混勻，標(biāo)記為刺激管，孵育4 h。將患兒、患兒母親和健康對(duì)照者的刺激管和未刺激管各分成4管，分別依次加入如下組合抗體(BD 公司，美國(guó))：CD3-PerCP/IgG1-PE/CD8-APC，CD3-PerCP/CDl54-PE/CD8-APC，CD3-PerCP/IgG1-PE，CD3-PerCP/CD69-PE。以CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞代表CD4+T淋巴細(xì)胞群作為分析對(duì)象，測(cè)定CD40L在其表面的表達(dá)情況?；純篊D3+CD8-T淋巴細(xì)胞CD40L比例為1.0%，其母親為16.8%，較正常對(duì)照明顯減少(1.0%，16.8%vs64.7%)(圖6)。

圖5 患兒家系淋巴細(xì)胞CD40LG基因CDS區(qū)cDNA擴(kuò)增后凝膠電泳圖

注 A：患兒及對(duì)照；B：患兒父母凝膠電泳

治療與隨訪：入院后先后予頭孢哌酮舒巴坦、米卡芬凈、更昔洛韋、伊曲康唑靜滴及復(fù)方磺胺甲噁唑口服抗感染治療，住院期間予丙種球蛋白支持治療及復(fù)方甘草酸苷、熊去氧膽酸護(hù)肝利膽治療，加用左甲狀腺素片口服治療，患兒好轉(zhuǎn)出院，出院后定期返院予IVIG治療，中性粒細(xì)胞較前升高(2.8～5.34)×109·L-1，仍間斷反復(fù)感染，皮膚黃染等肝功能損害較前好轉(zhuǎn)(18月齡復(fù)查ALT 49 IU·L-1，AST 70 IU·L-1)，生長(zhǎng)發(fā)育仍受限。

2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

檢索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方和維普數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索時(shí)間均從建庫(kù)至2019年4月11日。英文檢索關(guān)鍵詞“Hyper IgM syndrome”，共檢出3 893篇；中文檢索關(guān)鍵詞“高IgM綜合征”，共檢出233篇。HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄HIgM綜合征致病突變295個(gè)，CD40LG最多見(234個(gè))。常見致病突變類型為錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、缺失突變、剪切位點(diǎn)突變，其中以錯(cuò)義突變最多見。AICDA、CD40、UNG、IKBKG基因較CD40LG報(bào)道相對(duì)較少，亦以錯(cuò)義突變最常見?？截悢?shù)變異導(dǎo)致的HIgM綜合征病例的相關(guān)文獻(xiàn)共10篇(n=10)，其中英文8例，中文2例。7例為CD40LG基因拷貝數(shù)變異，均表現(xiàn)為大片段缺失，2例為國(guó)內(nèi)報(bào)道(不含本文報(bào)道，P6和P7)；3例為AICDA基因拷貝數(shù)變異，亦為大片段缺失，余致病基因無(wú)拷貝數(shù)變異(表3)。

表3 CNV所致HIgM綜合征病例匯總

注 IgG、IgA和IgM單位g·L-1；IC：胞內(nèi)區(qū)，TM：胞漿區(qū)，EC：跨膜區(qū)

3 討論

原發(fā)性免疫缺陷病(PID)是單基因突變導(dǎo)致免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫活性分子發(fā)生缺陷，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常的一組臨床綜合征。PIDs常缺乏明顯的基因型與表型相關(guān)性，同一基因不同突變可導(dǎo)致不同的臨床與免疫表型(RAG1基因不同突變可導(dǎo)致SCID、OMENN綜合征等), 而不同的基因突變又可以導(dǎo)致相似的臨床表型(OMENN綜合征可由RAG1、RAG2、LIG4、ADA等基因突變導(dǎo)致)。近年來(lái)每年都有很多新的PID致病基因通過(guò)NGS被確認(rèn)。但即使在二代測(cè)序技術(shù)的幫助下，最高也僅有30%～40%的PID患者得到基因診斷，在二代測(cè)序陰性病例中，拷貝數(shù)變異(CNVs)越來(lái)越受到關(guān)注。

CNV是由基因組重排導(dǎo)致的，一般指的是長(zhǎng)度>1 kb的大片段拷貝數(shù)增加或減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)[14]。隨著測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，CNV在PID的作用逐漸受到重視，包含DOCK8、CYBB、BTK等在內(nèi)的數(shù)十種PID相關(guān)基因已有CNV的相關(guān)報(bào)道[15]。目前全世界僅7例CD40LG基因大片段缺失報(bào)道，加上本文報(bào)道共8例，及3例AICDA基因CNV報(bào)道，本文為首次系統(tǒng)整理CNV所致高IgM綜合征(HIgM)。

HIgM為免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換障礙伴或不伴體細(xì)胞高頻突變的一種原發(fā)性免疫缺陷病，典型的免疫學(xué)表現(xiàn)為血IgG、IgA水平下降或缺乏，血IgM水平正?；蛏摺ＥR床主要表現(xiàn)為反復(fù)感染，如肺部細(xì)菌感染、中耳炎、胃腸道感染等，某些機(jī)會(huì)致病性感染發(fā)生率高，如卡式肺囊蟲、隱孢子蟲、弓形蟲感染等，且易罹患某些自身免疫性疾病及惡性腫瘤。經(jīng)典的HIgM綜合征分為5類：①CD40L缺陷；②CD40缺陷；③活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(AID) 缺陷；④尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶(UNG)缺陷；⑤其他，僅根據(jù)表型難以完全明確致病分子。

CD40L屬腫瘤壞死因子超家族成員，表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞表面，CD40屬TNF受體家族成員，持續(xù)表達(dá)于B細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞(APC)[16]。CD40-CD40L共刺激信號(hào)促進(jìn)B細(xì)胞活化、類別轉(zhuǎn)換及體細(xì)胞高頻突變，誘導(dǎo)記憶B細(xì)胞的形成，從而使B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體由IgM向IgG、IgA或者IgE轉(zhuǎn)換并且對(duì)T細(xì)胞依賴性抗原產(chǎn)生高親和力的抗體[17],同時(shí)影響CD4+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的相互作用，使細(xì)胞免疫受損。因此，CD40L的缺陷將導(dǎo)致導(dǎo)致X連鎖HIGM患者IgG、IgE和IgA水平明顯下降，但I(xiàn)gM水平正?；蛏撸籜HIGM患者存在正常數(shù)量的成熟B細(xì)胞，但是不能轉(zhuǎn)換為記憶B細(xì)胞，記憶B細(xì)胞數(shù)量減少。

本文患兒以反復(fù)感染起病，病程中出現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌、鼠傷寒沙門菌等機(jī)會(huì)致病菌感染，伴中性粒細(xì)胞減低及自身免疫性溶血性貧血、橋本甲狀腺炎等自身免疫疾病，外周血IgM水平正常，IgG、IgE和IgA均降低，逐漸出現(xiàn)肝膽系統(tǒng)病變，記憶B細(xì)胞及漿細(xì)胞明顯減少，臨床符合HIgM表現(xiàn)，由于缺乏陽(yáng)性家族史，難以明確致病分子。據(jù)HGMG數(shù)據(jù)庫(kù)，目前HIgM綜合征致病突變中，最常見的突變類型是點(diǎn)突變，其中錯(cuò)義突變最為多見。本文患兒二代測(cè)序常規(guī)生物信息學(xué)分析并未見致病突變位點(diǎn)，但患兒臨床表型典型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患兒CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞CD40L蛋白亦無(wú)表達(dá)，遂進(jìn)一步行CNV分析，發(fā)現(xiàn)CD40LG基因大片段缺失，進(jìn)一步擴(kuò)增其cDNA無(wú)產(chǎn)物，從而明確CD40LG基因CNV所致HIgM綜合征。

目前HIgM的基因型與臨床表型的關(guān)系尚不明確，但本文患兒大片段缺失與點(diǎn)突變患者臨床表型無(wú)明顯差異。例7除HIgM綜合征常見臨床表現(xiàn)外還存在孤獨(dú)癥，因曾有報(bào)道提示孤獨(dú)癥譜系障礙(ASD)患者[18]中有高頻率新發(fā)生的CNV，尤其是缺失型CNV，推測(cè)其獨(dú)特表型可能與CNV影響除CD40LG以外的其他基因有關(guān)。本文患兒母親為雜合CNV攜帶者，其CD40L表達(dá)降低，與點(diǎn)突變的攜帶者相比，雖無(wú)明顯感染表現(xiàn)，但其CD40L表達(dá)水平相對(duì)低下，因此母系家族中CD40L表達(dá)降低可能是作為大片段缺失變異的高危因素。

致謝：感謝邁基諾有限公司史麗娜老師對(duì)此文的幫助與指導(dǎo)。