黃海 陳梅 馬麗 李景平

相關(guān)研究證實(shí),女性妊娠時(shí)存在胎盤(pán)組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,起到了調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的作用,但是如果滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)度,將會(huì)造成一系列問(wèn)題的發(fā)生,如胎盤(pán)淺著床可能導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重建失敗的后果。胎盤(pán)血液灌注量減少,很容易造成子癇前期(preeclampsia,PE)的發(fā)生,由此可見(jiàn),一旦發(fā)生胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)度的問(wèn)題,就可能為子癇前期的出現(xiàn)提供條件［1］,由此可見(jiàn),很有必要對(duì)子癇前期胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡特征進(jìn)行研究,以便深入分析子癇前期發(fā)病機(jī)制。本研究通過(guò)對(duì)本院子癇前期產(chǎn)婦及正常產(chǎn)婦胎盤(pán)淋巴細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析,研究其與子癇前期的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究選取本院2016年6月1日～2017年11月30日住院分娩的無(wú)產(chǎn)科合并癥及內(nèi)外科合并癥產(chǎn)婦 60例,其中子癇前期產(chǎn)婦30例作為觀察組,正常產(chǎn)婦30例作為對(duì)照組。子癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《實(shí)用婦產(chǎn)科學(xué)》與子癇前期相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷［2］。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他產(chǎn)科合并癥且為單胎妊娠,觀察組產(chǎn)婦須符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)；均對(duì)研究干預(yù)知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他妊娠合并癥,可影響胎盤(pán)淋巴細(xì)胞凋亡產(chǎn)婦。觀察組年齡23～34歲,平均年齡(28.56±3.55)歲；孕周37～40周,平均孕周(37.97±0.93)周。對(duì)照組年齡23～33歲,平均年齡(28.31±3.62)歲；孕周37～40周,平均孕周(37.84±0.73)周。兩組產(chǎn)婦一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 試劑與儀器 本次研究中所采用的NYD-1000型彩色圖像分析系統(tǒng)是東南大學(xué)、南京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系研制,3-氨 丙 基 三 乙 氧 硅 烷(APES)、In Situ Cell Death Kit(AP)、DNase I Rnase free、RM2 135型石蠟切片機(jī)分別為美國(guó)Sigma公司、德國(guó)Boehringer Mannjeim公司、美國(guó)Promega公司、美國(guó)Leica公司生產(chǎn),光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn),此外H-600透射電鏡為日本Hitachi公司生產(chǎn)。

1.3 方法 ①電鏡標(biāo)本的制備：在4℃的條件下將胎盤(pán)組織標(biāo)本放置在3%戊二醛中進(jìn)行2 h的固定,用磷酸緩沖液(PBS)漂洗,在1%鋨酸常溫條件下進(jìn)行1 h的固定,然后用乙醇逐級(jí)脫水,再在室溫條件下用丙酮、包埋劑混合液浸透1 h。用Epon812樹(shù)脂包埋劑進(jìn)行固化處理,進(jìn)行半薄切片的制備,定位以后制成超薄切片,分別利用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色,之后進(jìn)行漂洗分化,于H-600型透視電鏡下觀察凋亡細(xì)胞不同形態(tài)變化。②對(duì)原位細(xì)胞凋亡進(jìn)行標(biāo)記：對(duì)石蠟包埋的胎盤(pán)組織進(jìn)行切片處理,滴加標(biāo)記液體,并將抗熒光素抗體(具有堿性磷酸酶)標(biāo)記好,以上各步驟均完成后采用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次沖洗,待緩沖液Ⅲ平衡以后,滴加顯色液,于室溫條件下暗處可以顯色到陽(yáng)性,待照片顯色良好時(shí)終止反應(yīng),于鏡下觀察。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)工作采用NYD21000型圖像分析系統(tǒng)輔助完成,并自動(dòng)對(duì)觀察區(qū)域絨毛面積進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下超微病理結(jié)構(gòu)特征 電鏡下,觀察組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中異常形態(tài)變化表現(xiàn)出不同形態(tài),與對(duì)照組滋養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯不同(見(jiàn)圖1)；細(xì)胞核的形態(tài)不規(guī)則,部分細(xì)胞有凋亡小體形成；胞漿內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度退變,線粒體排列紊亂；滋養(yǎng)細(xì)胞空泡化等出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化(見(jiàn)圖2)。

圖1 透射電鏡下正常胎盤(pán)組織中合體滋養(yǎng)細(xì)胞

圖2 透射電鏡下重度子癇前期胎盤(pán)組織中合體滋養(yǎng)細(xì)胞

2.2 標(biāo)記原位細(xì)胞凋亡結(jié)果 光鏡下,觀察凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出紫藍(lán)色,凋亡滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核縮成團(tuán)狀。觀察組子癇前期絨毛面積為(219693.59±98120.88)μm2,對(duì)照組為(214212.28±93128.79)μm2,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.2219,P＞0.05)；觀察組每10000 μm2絨毛面積中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)為(1.579±0.655)個(gè),與對(duì)照組的(0.031±0.021)個(gè)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.938,P＜0.01)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 觀察組與對(duì)照組胎盤(pán)組織在二倍體峰前均有Apo峰出現(xiàn)。

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn),子癇前期多數(shù)胎盤(pán)功能成熟后即開(kāi)始發(fā)病,如果不能在產(chǎn)后2～3 d內(nèi)進(jìn)行及時(shí)的治療,多項(xiàng)臨床癥狀將會(huì)消失,提示妊娠為子癇前期發(fā)病的一項(xiàng)基本因素［3］。葡萄胎、腹腔妊娠均可以引發(fā)子癇前期,前者提示胎兒本身在子癇前期發(fā)病中作用不大,后者提示子宮對(duì)子癇前期發(fā)病作用也不大［4,5］。

母胎界面的蛻膜內(nèi)有絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、免疫細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞組成的相互影響、相互制約的網(wǎng)絡(luò)狀免疫微環(huán)境。其淋巴細(xì)胞中,大顆粒淋巴細(xì)胞的比例高達(dá)45%,且處于特定的功能狀態(tài)。淋巴細(xì)胞凋亡異?？蓪?dǎo)致母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡異常,致使細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮內(nèi)膜侵入不良——“淺著床”和血管重鑄障礙,繼而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生［6］。本次研究中,采用電鏡掃描、TUNEL等技術(shù)手法,通過(guò)檢測(cè)子宮壁滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的情況可以發(fā)現(xiàn),電鏡下,觀察組胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中異常形態(tài)變化表現(xiàn)出不同形態(tài),與對(duì)照組滋養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯不同；細(xì)胞核的形態(tài)不規(guī)則,部分細(xì)胞有凋亡小體形成；胞漿內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度退變,線粒體排列紊亂；滋養(yǎng)細(xì)胞空泡化等出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化。光鏡下,觀察凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出紫藍(lán)色,凋亡滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核縮成團(tuán)狀。觀察組子癇前期絨毛面積為(219693.59±98120.88)μm2,對(duì)照組為(214212.28±93128.79)μm2,比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.2219,P＞0.05)；觀察組每10000 μm2絨毛面積中滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)為(1.579±0.655)個(gè),與對(duì)照組的(0.031±0.021)個(gè)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.938,P＜0.01)。觀察組與對(duì)照組胎盤(pán)組織在二倍體峰前均有Apo峰出現(xiàn)。

總之,子癇前期患者胎盤(pán)存在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡特征,可能與子癇前期的發(fā)展有一定相關(guān)性。