何佳怡 衛(wèi)旭東 何健 王心怡 呂睿 馬青

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,喉癌的發(fā)病率占耳鼻咽喉部位惡性腫瘤的 7.9%～35.0%［1］,近40%患者確診時已為Ⅲ期或Ⅳ期。此時,采用外科手術(shù)治療的方法效果有 限［2,3］。近年來,化療在喉癌治療中的地位日益提高。然而,耐藥性的產(chǎn)生成為化療失敗的重要原因之一,已有研究認為,腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的機制中,三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒(adenosine triphosphate-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的過表達是重要原因之一,它能消耗能量將底物從細胞內(nèi)泵 出［4］。P-gp和ABCG2屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族中常見的兩種蛋白,可將多種內(nèi)源性和外源性化合物泵出細胞外,與腫瘤干細胞耐藥性有密切關(guān)系［5,6］。腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)是腫瘤組織中存在的一部分具有干細胞性質(zhì)的細胞,理論認為腫瘤細胞起源于CSC,并常具有耐藥特性［7］。葫蘆素E是一類提取自葫蘆科植物的四環(huán)三萜類化合物,近年來有研究表明,葫蘆素E具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用［8］。但對人喉癌腫瘤干細胞的耐藥抑制及其潛在的分子機制尚不清楚,因此,本研究擬通過探究葫蘆素E對喉癌干細胞增值、遷移、侵襲等生理活動的影響,并尋找相關(guān)的分子機制,探究葫蘆素E對于喉癌干細胞耐藥性的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人喉癌細胞株Hep-2購買自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫。胎牛血清(FBS)以及Matrigel購買于美國Gibco公司。Transwell 小室購自美國Costar公司,鼠抗人P-gp抗體及抗人ABCG2抗體購自美國Santa Cruz公司,葫蘆素E以及FITC標記的CD133抗體購自美國Sigma公司。

1.2 細胞分選與培養(yǎng) 喉癌細胞株 Hep-2購自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),細胞生長至80%的密度時進行傳代。本實驗通過流式細胞儀分選CD133+腫瘤干細胞,分選出的喉癌干細胞在前述相同條件下進行培養(yǎng)與傳代。

1.3 CCK-8法檢測葫蘆素E對干細胞增殖能力的影響 采用CCK-8法檢測葫蘆素E對細胞增殖作用的影響。在96孔板中每孔種入10000個細胞,用不同濃度葫蘆素E(0、2.5、25.0、50.0、70.0 μmol/L)培養(yǎng),每個濃度設(shè)3復孔。作用12、24、36 h后,加入10 μl CCK8,37℃孵育2 h測吸光度。

1.4 Transwell實驗檢測葫蘆素E對干細胞遷移和侵襲能力的影響 24孔板中加入0.1% BSA-RPMI 1640培養(yǎng)基600 μl,將Transwell小室置于24孔板中,用不同濃度葫蘆素E培養(yǎng)。12 h后取出小室,用甲醛于室溫固定0.5 h,結(jié)晶紫染色0.5 h。顯微鏡拍照,并計算穿過濾膜的細胞數(shù),每膜計數(shù)5個隨機不同視野,每組設(shè)3次重復。侵襲實驗將Transwell小室濾膜內(nèi)表面涂以Matrigel 5 μg形成人工重組基底膜,其余步驟與侵襲相同。

1.5 Western Blot檢測葫蘆素E對干細胞相關(guān)蛋白表達水平的影響 細胞生長至80%密度時,采用不同濃度葫蘆素E培養(yǎng)細胞24 h后,使用RIPA提取蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品,用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,后用含脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h,將一抗覆蓋膜后孵育2 h,并加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h后,送至暗室中加入ECL試劑,并在ImageQuant 350電泳凝膠成像分體系統(tǒng)中曝光拍照,借助Image J軟件對圖像進行分析。

2 結(jié)果

2.1 葫蘆素E對喉癌干細胞增殖的影響 實驗中用不同濃度的葫蘆素E處理干細胞后,采用CCK-8法檢測葫蘆素E對干細胞的增殖的抑制作用。結(jié)果表明,相較葫蘆素E濃度為0 μmol/L時葫蘆素E能夠明顯抑制干細胞體外增殖活性,隨著葫蘆素E濃度的增加而增強,細胞存活率下降。見圖1。

圖1 葫蘆素E對喉癌干細胞增殖的影響

2.2 葫蘆素E對喉癌干細胞遷移的影響 實驗中用不同濃度的葫蘆素E處理干細胞后,采用Transwell實驗來檢測葫蘆素E對干細胞的遷移的抑制作用。結(jié)果表明,相較對照組,葫蘆素E能夠明顯抑制干細胞遷移能力,并且該作用隨著葫蘆素E濃度的增加而增強。見圖2。

圖2 葫蘆素E對喉癌干細胞遷移的影響

2.3 葫蘆素E對喉癌干細胞侵襲的影響 實驗中用不同濃度的葫蘆素E處理干細胞后,采用Transwell實驗來檢測葫蘆素E對干細胞的侵襲的抑制作用。結(jié)果表明,相較葫蘆素E濃度為0 μmol/L時葫蘆素E能夠明顯抑制干細胞侵襲能力,并且該作用隨著葫蘆素E濃度的增加而增強。見圖3。

圖3 葫蘆素E對喉癌干細胞侵襲的影響

2.4 葫蘆素E對耐藥相關(guān)蛋白表達的影響 用不同濃度的葫蘆素E處理喉癌干細胞后,提取細胞蛋白以通過Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果表明,葫蘆素E抑制了腫瘤耐藥相關(guān)蛋白ABCG2以及P-gp蛋白的表達水平。見圖4。

圖4 葫蘆素E對耐藥相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

通過實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),葫蘆素E能使喉癌干細胞增殖、遷移以及侵襲能力受抑制、促進細胞凋亡,并能夠降低喉癌細胞耐藥性相關(guān)的ABCG2及P-gp蛋白的表達,該效應(yīng)存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。

近年來研究顯示,在腫瘤細胞中存在著少數(shù)具有異質(zhì)性的亞群,其在形態(tài)、表型、增殖能力以及致瘤能力等方面存在很大差異,被認為具有腫瘤起始能力,故稱之為腫瘤干細胞［9］。耐藥性作為腫瘤干細胞的特性之一,多數(shù)耐藥分子如 Br-cp1/ABCG2、MRP1/2 等通常在喉部、消化道、肝腎等組織中均有不同程度的表達,這些分子在維持機體的生理屏障如血腦屏障、血睪屏障、母體-胎兒屏障、胎盤和血腦脊髓液屏障處發(fā)揮極其重要的作用［10］。在腫瘤干細胞膜上的 ABC 轉(zhuǎn)運體家族膜蛋白高表達,這些轉(zhuǎn)運體蛋白可有效地將許多代謝產(chǎn)物、藥物等物質(zhì)排出,使得化療藥物對腫瘤干細胞的殺傷作用明顯減弱。腫瘤干細胞多藥耐藥是腫瘤化療的主要障礙,嚴重影響著患者的預后和生存率。

P-gp與ABCG2作為ABC 轉(zhuǎn)運體家族膜蛋白的代表,在腫瘤細胞的耐藥性形成中發(fā)揮著重要的作用。P-gp是發(fā)現(xiàn)較早并且研究較多的一種耐藥蛋白,它由mdrl基因編碼,是一種能量依賴性的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。ABCG2則最初由乳腺癌細胞中提取,介導多藥耐藥機制。其共同特征在于能利用水解ATP釋放的能量將攝入細胞內(nèi)的藥物排出,降低胞內(nèi)藥物濃度,減少藥物對于癌細胞的損傷,從而參與癌細胞的耐藥機制。

葫蘆素E是廣泛存在于葫蘆科植物的一類四環(huán)三萜類化合物［11］,研究表明,葫蘆素E藥理作用廣泛,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用。葫蘆素E可直接破壞腫瘤細胞骨架［12］,產(chǎn)生細胞毒性并誘導細胞凋亡或死亡,還可通過下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白cyclin B1與cyclinA、CDK1以及CDC25C,發(fā)揮阻滯細胞周期的作用［18,19］。此外,還有研究發(fā)現(xiàn),通過抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3的磷酸化,葫蘆素E可對腫瘤細胞的遷移與侵襲起到抑制作用［13］?，F(xiàn)有研究表明,葫蘆素E對結(jié)腸癌、乳腺癌、喉癌等多種起源的腫瘤細胞造成明顯抑制［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),葫蘆素E可以使喉癌干細胞的增殖、遷移、侵襲以及細胞周期受到抑制,促進細胞凋亡,該效應(yīng)存在劑量-反應(yīng)關(guān)系,這一結(jié)果支持了前述研究的觀點。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)葫蘆素E還能減低耐藥相關(guān)基因的表達,下調(diào)耐藥蛋白ABCG2及P-gp水平,從而減少耐藥蛋白對于細胞毒性物質(zhì)的外排,并最終起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。通過抑制喉癌干細胞的生理活動,葫蘆素E可抑制腫瘤組織的活性,并可通過逆轉(zhuǎn)耐藥作用,提高化療藥物的作用效果。

綜上所述,葫蘆素E能顯著抑制人喉癌干細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并促進細胞凋亡、下調(diào)蛋白ABCG2及P-gp的表達水平,葫蘆素E對于喉癌干細胞的抑制作用,可能與其直接抑制細胞周期、促進細胞凋亡、影響細胞通路有關(guān),也可能與其下調(diào)耐藥相關(guān)蛋白表達,減低干細胞耐藥性有關(guān),這使葫蘆素E有望成為對喉癌靶向治療藥物。而葫蘆素E應(yīng)用于臨床的有效性以及安全性等,仍是有待進一步研究的問題。