張躍新，胡 偉，郝藝銘，閆寶松，馬 鳳，么宏偉**

（1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

黑木耳［Auricularia auricula-judae（Bull.）Quel.］，又稱木耳、黑菜，隸屬真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門 （Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳屬（Auricularia），是中國傳統(tǒng)的主要食用菌品種［1］。近年來我國應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定黑木耳種質(zhì)資源取得了較大進(jìn)展。周雁等［2］對(duì)黑木耳和毛木耳轉(zhuǎn)錄序列進(jìn)行了微衛(wèi)星序列分布特征的研究，結(jié)果表明三堿基和六堿基重復(fù)的微衛(wèi)星出現(xiàn)最多；馬銀鵬等［3］應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)黑龍江省黑木耳主栽品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將黑龍江黑木耳主栽品種分為3大類；徐安然等［4］構(gòu)建了黑木耳SSR分子身份證。

近年來筆者深入大小興安嶺、長白山、東寧、綏陽、林口、亞布力等地，收集并采集黑木耳野生菌株與主栽品種共23份，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黑龍江省區(qū)域的部分黑木耳主栽品種及野生菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析，為黑木耳品種資源鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

在大小興安嶺、長白山、東寧、綏陽、林口、亞布力等黑木耳主要自然生長地，野外采集的黑木耳菌株8個(gè)；收集主要栽培菌株11個(gè)，收集地重點(diǎn)選擇黑木耳主要栽培地區(qū)；與其他科研院所交換引進(jìn)的黑木耳登記品種4個(gè)。經(jīng)分離、純化與擴(kuò)繁培養(yǎng)，獲得純菌株23個(gè)，序號(hào)分別為菌株1～菌株23。各株菌來源和子實(shí)體形態(tài)見表1。

1.2 黑木耳DNA提取

從保存的菌株斜面上挑取菌絲塊接種到PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)。7 d后用5 mm打孔器切取菌塊接種到液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)10 d后，將培養(yǎng)液中的菌絲體用無菌紗布過濾，無菌水洗滌多次后，用濾紙吸干水分，液氮速凍后-70℃保存。取50 mg的菌絲體，加液氮研磨成粉末狀，采用基因組DNA提取試劑盒（北京天根） 提取DNA，將提取的DNA溶解于TE緩沖液中，65℃水浴40 min，以充分溶解DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品DNA質(zhì)量，使用前每個(gè)樣品稀釋至濃度為 50 ng·μL-1。

1.3 黑木耳SSR引物設(shè)計(jì)

在 NCBI網(wǎng)站上 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）［5］搜索已經(jīng)發(fā)表的黑木耳基因組核酸序列，利用軟件SSRHunter 1.3搜索微衛(wèi)星位點(diǎn)，在微衛(wèi)星位點(diǎn)側(cè)翼序列上下游各150 bp左右位置，利用軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)黑木耳SSR引物10對(duì)，見表2。

表2 黑木耳10對(duì)SSR引物Tab.2 Ten SSR primers of Auricularia auricula-judae

1.4 黑木耳SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：2.5 μL 10 × PCR Buffer，2.5 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），0.5 μL DNA聚合酶（5 U·mL-1），1 μL上游引物（10 μmol·L-1），1 μL下游引物（10 μmol·L-1），1 μL模板DNA（50 ng·μL-1），補(bǔ)去離子水至25 μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.5 PCR-SSR引物驗(yàn)證

以林耳1號(hào)為DNA模板，設(shè)計(jì)的10對(duì)引物對(duì)目的DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物介于100 bp～500 bp所對(duì)應(yīng)的引物作為目標(biāo)引物。

1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR-SSR產(chǎn)物的變性、制備聚丙烯酰胺變性凝膠電泳板、上板、電泳、銀染等試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［6］。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)銀染檢測(cè)結(jié)果，把每1對(duì)SSR引物檢測(cè)出的1個(gè)位點(diǎn)，同時(shí)將數(shù)據(jù)以0-1型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)記錄，即有帶記為1，無帶記為0。把每1條多態(tài)性條帶記為1個(gè)等位基因，以POPGEN32分析所得數(shù)據(jù)及參數(shù)。應(yīng)用DPS 16.05軟件，根據(jù)遺傳距離的類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，獲得樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳基因組DNA提取結(jié)果

黑木耳基因組DNA提取結(jié)果見圖1。

圖1 黑木耳DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis picture of Auricularia auricula-judae

對(duì)提取的黑木耳DNA進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。圖1結(jié)果表明，23個(gè)菌株DNA條帶比較清晰，無拖尾、彌散等現(xiàn)象，說明提取的DNA比較純，基本無降解，符合試驗(yàn)要求，可用于SSR-PCR反應(yīng)（M為DL20 000 DNA Marker）。

2.2 SSR-PCR引物篩選結(jié)果

SSR-PCR引物篩選結(jié)果見圖2。

圖2 SSR引物復(fù)篩電泳圖Fig.2 Rescreen electrophoresis diagram of SSR primer

由圖2可以看出，10對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于100 bp～400 bp，目標(biāo)條帶清晰，產(chǎn)物長度符合SSR試驗(yàn)要求（引物號(hào)為表2所示引物編號(hào)，M為DL20 000 DNA Marker）。

2.3 不同黑木耳SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果

不同黑木耳SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果見表3、圖3和圖4。

結(jié)果表明，同一SSR引物擴(kuò)增的不同菌株，擴(kuò)增的條帶個(gè)數(shù)與片段大小不盡相同（圖3、圖4）。由表3可以看出，利用10對(duì)引物對(duì)23個(gè)菌株進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出44個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶42條，多態(tài)性為95.5%。單條引物擴(kuò)增條帶為2條～7條，平均4.4條，擴(kuò)增長度介于100 bp～1 000 bp，以300 bp～700 bp居多。擴(kuò)增條帶數(shù)最少的引物為MR003、MR008、MR011，擴(kuò)增的條帶均為2條；擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物為MR005，擴(kuò)增條帶為7條。

表3 10對(duì)SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析Tab.3 Analysis on genetic diversity of 10 SSR molecular markers.

圖3 引物MR005擴(kuò)增條帶Fig.3 Amplification band of primer MR005

圖4 引物MR010擴(kuò)增條帶Fig.4 Amplification band of primer MR010

表3的單條引物擴(kuò)增結(jié)果表明，等位基因頻率最小值 0.080（MR011），最大值 0.470（MR005），均值0.201；有效等位基因數(shù)最小值1.040（MR008），最大值 1.990（MR005），均值 1.460；各標(biāo)記位點(diǎn)有效等位基因數(shù)小于等位基因數(shù)，表明黑木耳基因組存在一些高頻的等位基因。所有標(biāo)記中MR005擴(kuò)增效果最好，多態(tài)性最為豐富。而MR008表現(xiàn)最差。多態(tài)性信息含量0.050～0.320，均值為0.216，Shannon信息指數(shù)0.100～0.690，均值0.455，表明供試黑木耳菌株具有遺傳多樣性。

2.4 基于SSR分子標(biāo)記聚類分析

應(yīng)用DPS 16.05軟件，根據(jù)遺傳距離Nei Li（Czekanowski 1913） 法及類平均法 （UPGMA） 進(jìn)行聚類分析結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 基于SSR分析的黑木耳23菌株聚類診斷圖Fig.5 23 strains cluster diagnosis of Auricularia auricula-judae based on SSR analysis

根據(jù)聚類類別數(shù)診斷圖（圖5），在遺傳相似系數(shù)為0.45時(shí)，可將聚類結(jié)果劃分為4類（圖6）。第1類為菌株林2；第2類為特6；第3類為林5、黑29、黑威15等19個(gè)菌株；第4類為林1、林3。聚類結(jié)果表明，劃分的4個(gè)類群中，第1類只有1個(gè)菌株林2，采自于長白山汪清縣，與其他菌株遺傳距離最遠(yuǎn)；第2類只有1個(gè)菌株特6，來自于黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，與其它菌株遺傳距離較遠(yuǎn)；第3類包含19個(gè)菌株，19個(gè)菌株由于地理來源廣泛，且菌株數(shù)量較多，是北方地區(qū)的主栽類群，該類群在相似系數(shù)為0.25時(shí)又可將第3類分為3組：第 1組為林 5，第2組為黑29、黑威 15、Au-5、Au-卷邊、Au-Y、Au-碗耳、特2、興安1號(hào)、興安2號(hào)、林4、林7、林8、林9，第3組為Au特黑、林6、黑山、新代5、林10；第4類只有2個(gè)菌株林1、林3，分別來自牡丹江地區(qū)的穆棱和林口。

圖6 基于SSR分析的黑木耳23菌株聚類圖Fig.6 Cluster diagram of 23 strains Auricularia auricula-judae based on SSR analysis

3 討論

本研究中供試菌株多數(shù)來源于北方地區(qū)黑木耳栽培品種及林區(qū)采集的野生菌株，其中Au-碗兒引自浙江地區(qū)，Au-卷邊引自湖北地區(qū)，這兩個(gè)品種在北方地區(qū)也經(jīng)過大面積多年栽培，已成為北方地區(qū)黑木耳主栽品種。本研究應(yīng)用SSR法對(duì)北方地區(qū)黑木耳主栽品種和野生菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析。研究表明，SSR序列廣泛分布于真核生物基因組中［7-9］。由于SSR標(biāo)記具有共顯性遺傳、多態(tài)性高及在基因組中分布廣泛的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定［10-11］、遺傳多樣性的研究［12-13］、遺傳圖譜的構(gòu)建［14］和基因定位［15-16］等眾多方面。

本研究結(jié)果表明，北方地區(qū)大部分主栽品種和野生菌株聚到了第3類群-主栽類群，說明該地區(qū)黑木耳栽培品種之間及栽培種與野生菌株間遺傳背景差異不大。原因可能有3種：一是設(shè)計(jì)的引物較少，其擴(kuò)增的位點(diǎn)未能體現(xiàn)出木耳的遺傳差異性；二是北方地區(qū)是我國黑木耳主產(chǎn)區(qū)，栽培規(guī)模較大，可能發(fā)生分生孢子漂移現(xiàn)象，導(dǎo)致野生種與栽培種遺傳距離較近；三是栽培品種間可能出現(xiàn)了相互雜交現(xiàn)象，導(dǎo)致各品種間遺傳距離較近。