張 姣德 吉朱孟夏盧 燕?付愛(ài)玲?陳道峰

（1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；3.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

柏科刺柏屬多種植物的枝葉和果實(shí)具有清熱、祛風(fēng)除濕等功效［1-3］，在藏藥中又稱徐巴，收載于 《晶珠本草》，其香味獨(dú)特，在藏族人民生活中還被視為重要的熏香植物，用作焚香、驅(qū)蟲(chóng)［4］。徐巴為著名藏藥浴五味甘露湯的組成成分之一，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腰腿疼等疾?。?］，也在其他藏藥方劑中使用，如十味訶子丸、十四味羚牛角丸、二十味檳榔丸等，其基源復(fù)雜，常見(jiàn)的有香柏、大果圓柏、密枝圓柏、滇藏方柏枝、高山柏、垂枝香柏等10 多種。刺柏屬植物枝葉中富含揮發(fā)油（0.28～1.5%）［6-10］，主要為單萜烯、含氧倍半萜等類成分，并顯示出豐富的生物活性，如高山柏、方枝柏、滇藏方枝柏、大果圓柏?fù)]發(fā)油具有抗菌活性［10］，方枝柏、高山柏?fù)]發(fā)油同時(shí)具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性［11］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香柏干燥枝葉中揮發(fā)油含有量高達(dá)3.50%，并具有抗炎活性［12］，因此刺柏屬植物的揮發(fā)性成分值得進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)。

迄今為止，HS-GC-MS 法已廣泛應(yīng)用于中草藥揮發(fā)性成分的研究［13］，與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法比較，該方法樣品需要量小，前處理簡(jiǎn)單，操作完全自動(dòng)化［14］。刺柏屬植物采樣困難，采樣量少，并且在傳統(tǒng)應(yīng)用中將其枝葉干燥后點(diǎn)燃作為熏香使用，頂空進(jìn)樣方式更貼近于實(shí)際應(yīng)用，故本實(shí)驗(yàn)采用HS-GC-MS 法對(duì)刺柏屬6種植物枝葉和果實(shí)中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，為刺柏屬植物的進(jìn)一步研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

Shimadzu AOC-5000 Plus 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；TG-5MS 毛細(xì)管柱（320 μm × 30 m，1 μm）（美國(guó)Thermo 公司）；AL204 電子天平（萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；C7～C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

6種刺柏屬植物的枝葉和果實(shí)在西藏采集，經(jīng)西藏大學(xué)德吉博士鑒定為正品，標(biāo)本存放于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 頂空進(jìn)樣 分別精密稱取干燥的6種刺柏屬植物枝葉和大果圓柏及滇藏方枝柏果實(shí)粉末0.002 g，放入20 mL頂空瓶中，密封后置于樣品盤(pán)內(nèi)，進(jìn)樣體積2 mL；體積流量 1.0 mL／min；不分流模式；加熱溫度 120 ℃；加熱時(shí)間20 min；振動(dòng)速度 400 r／min；加熱程序加熱 10 s，靜止10 s。

表1 樣品信息

2.1.2 氣相色譜 TG-5MS 石英毛細(xì)管非極性柱（30 m×0.32 mm，1.00 μm）；載氣 He；柱體積流量 1.0 mL／min；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；柱溫程序起始柱溫 40 ℃（保持8 min），以 1 ℃ ／min 升至 250 ℃（保持 30 min）；進(jìn)樣量1 μL；不分流。

2.1.3 質(zhì)譜 電子轟擊（EI）離子源；能量70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度 280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m／z50～1 000；質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)檢索庫(kù) NIST14。

2.2 GC-MS

2.2.1 揮發(fā)性成分總離子流圖 在 “2.1”項(xiàng)條件下對(duì)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，刺柏屬植物密枝圓柏、高山柏、垂枝香柏和香柏的枝葉，以及大果圓柏和滇藏方枝柏枝葉和果實(shí)中揮發(fā)性成分進(jìn)行HS-GC-MS 分析，得到總離子流圖，見(jiàn)圖1，樣品及主峰編號(hào)見(jiàn)表2。

2.2.2 揮發(fā)性成分組分分析 所得GC-MS 譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)NIST14 譜圖庫(kù)檢索解析，結(jié)合相對(duì)保留指數(shù)查對(duì)文獻(xiàn)，確認(rèn)各化合物［15-18］，共鑒定出62種揮發(fā)性成分，并采用面積歸一法確定其相對(duì)含有量，見(jiàn)表2。

密枝圓柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分42種，占全部揮發(fā)性成分相對(duì)含有量的98.82%，共6 類組分，其中單萜烯類 13種，占 74.13% ；含氧倍半萜類 7種，占 15.15% ；倍半萜烯類14種，占 6.67%；含氧二萜類 1種，占 1.81%；含氧單萜類 5種，占 1% ；異戊酸酯類 1種，占 0.06% ，主要成分為 α-蒎烯（44.51% ）、β-蒎烯（12.36% ）、D-檸檬烯（9.54%）和欖香醇（9.32%）。

高山柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分43種，占全部揮發(fā)性成分相對(duì)含有量的97.65%，成分類別與密枝圓柏相同，但13種倍半萜烯類的含有量占14.14%，是密枝圓柏的2倍以上，主 要成分 為 β-蒎烯（28.23%）、偽 檸 檬 烯（17.3%）、α-蒎烯（13.42%）、茅蒼術(shù)醇（6.79%）和欖香醇（6.38%）。

垂枝香柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分35種，相對(duì)含有量占總成分的90.08%，只鑒定出5 類組分，不含異戊酸酯類，主要成分為α-松油烯（33.7% ）、α-蒎烯（13.7% ）和β-蒎烯（10.93%）。

圖1 枝葉和果實(shí)中揮發(fā)性成分總離子流圖

香柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分39種，相對(duì)含有量占總成分的97.66%，同樣為6 類組分，但其中單萜烯類含有量明顯較其他5種刺柏屬植物高，占84.17%，主要成分為β-蒎 烯（38.13%）、β-月桂烯（21.19%）和α-蒎烯（20.5% ）。

大果圓柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分44種，相對(duì)含有量占總成分的98.25%，也包括6 類組分，其中含氧倍半萜類含有量在6種刺柏屬植物中最高，占21.64%，主要成分為 β-蒎 烯（37.34%）、α-蒎烯（18.84%）和欖香醇（16.59% ）。

滇藏方枝柏枝葉中共鑒定出揮發(fā)性成分41種，相對(duì)含有量占總成分的91.74%，鑒定出5 類組分，不含異戊酸酯類，而且其中倍半萜烯類含有量較其他5種刺柏屬植物高，占25.76% 。主要為 β-蒎烯（29.86%）、α-蒎烯（11.8%）、大根香葉烯D-4-ol（8.25%）、欖香醇（7.57%）和 γ-蓽澄茄烯（6.68%）。

表2 枝葉和果實(shí)中揮發(fā)性成分

續(xù)表2

2種果實(shí)成分與各自的枝葉相比有所減少，成分類別與枝葉相同，但單萜烯含有量明顯提高，高達(dá)80% 以上，而含氧倍半萜、倍半萜類明顯減少。其中從大果圓柏果實(shí)中共鑒定出38種成分，相對(duì)含有量占總成分的99.52%，主要為 β-蒎烯（45.41%）、α-蒎烯（24.35%）和欖香醇（8.66%）；滇藏方枝柏果實(shí)中鑒定出的35種成分占總含有量的 96.37%，主 要 為 β-蒎 烯（56.59%）和 α-蒎 烯（13.58% ）。

2.2.3 揮發(fā)性成分聚類分析 比較刺柏屬植物枝葉和果實(shí)的揮發(fā)性成分可知，其組成成分類別相似，但果實(shí)部位單萜烯類相對(duì)含有量達(dá)到80%以上，最主要的成分β-蒎烯含有量超過(guò)45%，與枝葉差異顯著。為了進(jìn)一步區(qū)分不同種刺柏屬植物枝葉之間的差別，對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類分析。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SPSS 20.0 軟件，采用系統(tǒng)聚類方法，以Ward’s 聚類法的 Educlidean 距離為測(cè)度，62種揮發(fā)性成分的相對(duì)含有量為變量，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。在距離為25 時(shí)將6種刺柏屬植物聚為2 類，其中密枝圓柏和垂枝香柏分為一類，其余4種分為第二類；大果圓柏和滇藏方枝柏在距離為1 時(shí)聚在一起，距離系數(shù)最小，共有成分有30種，共有成分含有量達(dá)到70%以上，兩者在揮發(fā)性成分類別和相對(duì)含有量上都比較相似，且都以β-蒎烯與α-蒎烯為最主要的2種成分；大果圓柏、滇藏方枝柏、高山柏和香柏在距離為7 時(shí)聚為一大類，24種共有成分含有量也達(dá)到70%以上，其中最高的成分均為β-蒎烯，香柏因其βmyrcene 含有量與其他3種刺柏屬植物差異較大而距離更遠(yuǎn)；密枝圓柏和垂枝香柏在距離為20 時(shí)聚為一類，距離系數(shù)大，雖然25種共有成分相對(duì)含有量高達(dá)80%以上，但其主要成分不同，分別為α-蒎烯和α-松油烯，對(duì)聚類結(jié)果影響較大。

圖2 枝葉揮發(fā)性成分聚類樹(shù)狀圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別稱取 20、10、5、2 mg 刺柏屬植物枝葉和果實(shí)粉末，對(duì)樣品質(zhì)量條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示當(dāng)樣品量為5、2 mg 時(shí)，分離色譜峰效果較好，因此確定樣品用量為2 mg。與已報(bào)道的傳統(tǒng)水蒸氣法對(duì)比，涂永勤等［16］從100 g 香柏中提取揮發(fā)油鑒別其揮發(fā)性成分，董艷芳等［17］稱取200 g 垂枝香柏提取其揮發(fā)油，可見(jiàn)頂空進(jìn)樣法用樣量極少，不需提取，操作簡(jiǎn)便快捷。

通過(guò)HS-GC-MS 法基本可以將刺柏屬植物果實(shí)和枝葉部分從揮發(fā)性成分上加以區(qū)分，尤其各主成分含有量占比較高，對(duì)區(qū)分不同部位及不同品種樣品的貢獻(xiàn)較大。針對(duì)香柏這一種植物，可對(duì)其果實(shí)進(jìn)行進(jìn)一步研究，進(jìn)而探討其特殊性。同時(shí)，不同種刺柏屬植物揮發(fā)性成分之間的差異與其DNA 分子鑒定和藥效作用的相關(guān)性也值得進(jìn)一步探究。

α-蒎烯和β-蒎烯是6種刺柏屬植物枝葉和果實(shí)中揮發(fā)性成分所共有的，且相對(duì)含有量高居前三位。研究表明，α-蒎烯能通過(guò)抑制真菌的DNA、RNA，多糖以及麥角固醇的生物合成而達(dá)到抗真菌的作用［19］，對(duì)植物害蟲(chóng)如食菌小蠹、松小蠹、紅脂大小蠹等具有引誘能力［20-22］；β-蒎烯具有抗菌、抗病毒及抗腫瘤作用［23-24］。由此可見(jiàn)，這 2種化合物對(duì)刺柏屬植物的生物活性有重要影響意義。

涂永勤等［16］從香柏?fù)]發(fā)油中分析鑒定出α-杜松醇、α-小茴香烯和 3，-7，-11-甲基-2，-6，-10-十二碳三烯-1-醇，董艷芳等［17］在垂枝香柏?fù)]發(fā)油中鑒定出檜烯、α-可巴烯-11-醇、烴類含氧衍生物、4-萜品醇，Wedge 等［11］提取的高山柏?fù)]發(fā)油中含有量較高者為檜烯、α-蒎烯、欖香醇和松油烯-4-醇，Staub 等［25］采用頂空-氣質(zhì)法分析出高山柏香煙中α-杜松烯含有量最高。與本實(shí)驗(yàn)所報(bào)道的刺柏屬植物揮發(fā)性成分存在顯著差異，分析原因除了揮發(fā)油提取與頂空采集方式的區(qū)別外，很可能與樣品的產(chǎn)地有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用HS-GC-MS 法對(duì)刺柏屬植物6種枝葉和2種果實(shí)的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，通過(guò)譜庫(kù)檢索和文獻(xiàn)查閱，從枝葉中鑒定出62 個(gè)化合物，果實(shí)中鑒定出38個(gè)化合物，2 個(gè)部位的揮發(fā)性成分有明顯差異，并且不同種枝葉的主成分也有一定差異，為進(jìn)一步研究刺柏屬植物不同部位、品種間的藥效差異提供參考。該方法較傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法用樣量少，且操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了刺柏屬植物枝葉和果實(shí)揮發(fā)性成分的快速檢測(cè)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該屬植物提供理論依據(jù)。