梁 群，邢金梅，何學(xué)斌

（1.浙江省杭州市大江東醫(yī)院，浙江 杭州 311225；2.河北省保定市第二醫(yī)院，河北 保定 071000；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

纈草為敗醬科的1種耐寒可開花植物，種類復(fù)雜繁多，主要分布于溫帶地區(qū)，在我國主要產(chǎn)于東北至西南的廣大地區(qū)，大約有30種，作為1種傳統(tǒng)草藥材，早在古希臘時(shí)期就被人所認(rèn)識(shí)，而在我國明代也有其使用記錄。纈草入藥部位主要為根和莖，其提取物中含有單萜、倍半萜、環(huán)烯醚萜、揮發(fā)油、生物堿等多種成分，具有抗焦慮［1］、抗抑郁［2］、治療失眠［3］、抗腫瘤［4-5］、保肝［6］、護(hù)腎［7］等藥理作用，但目前相關(guān)制劑的開發(fā)利用較少。

課題組前期采用纈草環(huán)烯醚萜所用的TLC、HPLC 法（英國藥典、外文文獻(xiàn)推薦）來檢測國產(chǎn)纈草（采自神農(nóng)架、鄂西北、鄂西南、陜南、川東、湘西、黔東南、新疆），雖然未發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類纈草的標(biāo)志性成分——纈草三酯和異纈草三酯，但發(fā)現(xiàn)了另外3種含有量相當(dāng)高的物質(zhì)，經(jīng)過提取、分離、純化，并經(jīng)波譜分析鑒定結(jié)構(gòu)，三者異羥肟酸鐵反應(yīng)呈陽性，提示為內(nèi)酯類物質(zhì)，暫命名為纈草萜內(nèi)酯A、B、C。初步研究顯示，纈草浸膏對 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝硬化有一定防治作用，而以上3種成分為其中的主要成分，故推測纈草萜內(nèi)酯對肝纖維化也可能有一定的防治作用。目前，尚無關(guān)于纈草萜內(nèi)酯體外抗肝纖維化作用的報(bào)道，故本研究探討該成分對體外誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，并考察其對肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠HSC-T6 細(xì)胞株，由上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所饋贈(zèng)。

1.2 試劑 南美胎牛血清（批號(hào) SV30087.02，美國HyClone 公司）；DMEM 培養(yǎng)基［賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司］；枸櫞酸鐵銨、微量丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；次氮基三醋酸二鈉（NTA，批號(hào)N9877-5G）、四硝基偶氮唑鹽（MTT）、秋水仙素（批號(hào)C9754）、胰酶（美國 Sigma 公司）；二甲基亞砜（DMSO，北京防化研究院化工廠）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma 公司，型號(hào)55651-950）；熒光倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司，型號(hào)TE2000-S）；酶聯(lián)免疫檢測儀（香港基因有限公司，型號(hào)MX200）；臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司，型號(hào)TDZ4-WS）；精密移液器（德國 Eppendorf 公司）；水平搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，型號(hào) WD-9405B）。

1.4 藥物 纈草萜內(nèi)酯提取物由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)藥學(xué)研究所薛存寬教授提供，命名為纈草萜內(nèi)酯A、B、C，含有量＞98%，復(fù)旦大學(xué)、北京師范大學(xué)分析測試中心經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜、質(zhì)譜、DEPT、COSY 譜鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 方法

2.1 HSC-T6 培養(yǎng) 將凍存狀態(tài)的HSC-T6 于37 ℃下快速復(fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿單層（約2 d）后胰酶消化并傳代，臺(tái)盼藍(lán)法測定細(xì)胞活力。

2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HSC-T6，經(jīng)清洗、消化、吹打混勻后取 50 μL 懸液，加入 6 mL 含 3% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中稀釋，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104／mL，接種于 96 孔板，空白調(diào)零組不加細(xì)胞懸液，其余每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至近單層貼壁后取出傾去培養(yǎng)液，分別加入稀釋細(xì)胞懸液（正常對照組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、100、200、300、400 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯 A、B、C（實(shí)驗(yàn)組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋0.5 μg／mL 秋水仙堿（陽性對照組），平行 3 孔，繼續(xù)培養(yǎng) 36 h 后棄上清液，每孔加入 MTT 溶液（5 mg／mL）20 μL，37 ℃ 下繼續(xù)孵育 5 h，終止培養(yǎng)，離心（1 000 r／min）5 min 后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入 150 μL DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min 以使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀上在570 nm 波長處測定各孔光密度值（OD 值），平行測 3 次，記錄中位值。

2.3 抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期HSC-TC，清洗、消化、吹打混勻后取200 μL 懸液，加入12 mL 配制好的3%培養(yǎng)基中稀釋，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105／mL，接種于24 孔板，每孔500 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至近單層貼壁后取出，傾去培養(yǎng)液，加入稀釋細(xì)胞懸液（正常對照組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA（模型組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50、200、400 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯A、B、C（實(shí)驗(yàn)組）、稀釋細(xì)胞懸液＋0.1 mmol／L FeNTA＋50 μmol／L 維生素 E（陽性對照組），每孔加 200 μL 含藥培養(yǎng)液，平行2 孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h 后取上清液，按試劑盒說明書操作步驟檢測上清液中SOD、MDA 水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用（）表示，組間比較采用單因素方差分析和 SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞活力 0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色測定，細(xì)胞活力＞90%。

3.2 纈草萜內(nèi)酯 A、B、C 對 HSC-T6 增殖的影響 表1顯示，與正常對照組比較，模型組 HSC-T6 增殖明顯（P＜0.01）；與模型組比較，纈草萜內(nèi)酯 A、B、C 組 OD 值顯著降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

3.3 纈草萜內(nèi)酯 A、B、C 對 SOD 活性、MDA 水平的影響 表2顯示，與模型組比較，纈草萜內(nèi)酯 A、B、C 組 SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯 A、B 除外），并呈現(xiàn)劑量依賴性；與陽性對照組比較，纈草萜內(nèi)酯 C 400 μg／mL 組其活性顯著升高（P＜0.01）。

表3顯示，與模型組比較，纈草萜內(nèi)酯 A、B、C 組MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，50 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯A、B 除外），并呈劑量依賴性；與陽性對照組比較，纈草萜內(nèi)酯 C 400 μg／mL 組其水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 纈草萜內(nèi)酯A、B、C 對HSC-T6 增殖的影響（）

表1 纈草萜內(nèi)酯A、B、C 對HSC-T6 增殖的影響（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別OD 值纈草萜內(nèi)酯A 纈草萜內(nèi)酯B 纈草萜內(nèi)酯C正常對照組 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2 0.359 0±0.015 2模型組 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△ 0.869 5±0.015 3△△陽性對照組 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 0.634 3±0.017 4 400 μg／mL 組 0.568 9±0.009 6?? 0.482 1±0.008 3?? 0.418 1±0.005 7??300 μg／mL 組 0.614 6±0.018 3?? 0.563 1±0.014 8?? 0.494 3±0.015 6??200 μg／mL 組 0.701 0±0.018 1?? 0.665 8±0.015 3?? 0.603 7±0.022 5??100 μg／mL 組 0.850 9±0.024 9 0.750 5±0.014 3?? 0.694 0±0.023 7??50 μg／mL 組 0.861 3±0.021 8 0.856 2±0.022 6 0.782 5±0.008 2??

表2 纈草萜內(nèi)酯A、B、C 對SOD 活性的影響

表3 纈草萜內(nèi)酯A、B、C 對HSC-T6 培養(yǎng)液中MDA 水平的影響

4 討論

肝纖維化是慢性肝臟疾病進(jìn)展過程中的1 個(gè)必經(jīng)環(huán)節(jié)，為所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，其本質(zhì)是肝組織對損傷發(fā)生的過度修復(fù)應(yīng)答，導(dǎo)致瘢痕組織形成的病理過程，各種病因（病毒感染、酒精中毒、金屬超負(fù)荷等）引起肝臟損傷的病理過程不同，但其所致肝纖維化的最終途徑是相同，即肝星狀細(xì)胞激活。大量研究表明，HSC 無論正?；虿±頎顟B(tài)下都是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞［8-10］，本實(shí)驗(yàn)所用的HSC-T6 是正常大鼠肝星狀細(xì)胞，它與人類肝星狀細(xì)胞（LX-2）在形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、生長特點(diǎn)、標(biāo)志物方面都比較接近，是肝纖維化研究的理想細(xì)胞系，再將其與FeNTA共同培養(yǎng)，采用鐵超負(fù)荷法來制造氧化應(yīng)激的模型。劉梅等［11］應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的 FeNTA 培養(yǎng)大鼠肝 HSC，證實(shí)鐵劑可引起后者增殖，導(dǎo)致氧化-抗氧化失衡；MTT 法檢測HSC 的生長及存活率是 Mosmann［12］最早報(bào)道的，該方法操作簡便，經(jīng)濟(jì)快捷，靈敏度高，重復(fù)性好，廣泛用于生物因子活性的檢測，故本實(shí)驗(yàn)選擇該方法。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在調(diào)節(jié)體內(nèi)膠原基因表達(dá)的過程中起著主導(dǎo)作用，同時(shí)也是連接組織損傷和纖維化過程的紐帶，抗氧化劑可通過作用于肝細(xì)胞、HSC、Kupffer 等多種細(xì)胞及環(huán)節(jié)來減慢或阻止肝纖維化的發(fā)展［13-14］。機(jī)體受到刺激后，引起酶和非酶系統(tǒng)平衡失調(diào)，導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生，后者主要攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并形成大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如醛基（丙二醛MDA）、酮基、氫過氧基等。MDA 作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，間接反映了細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而其檢測常與SOD 相互配合，后者間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，對機(jī)體氧化-抗氧化平衡起到重要作用，故藥物抗氧化作用越強(qiáng)，MDA 水平越低，SOD 活性越高。

維生素E 是1種脂溶性抗氧化劑，又名生育酚（包括α、β、γ、δ 4種類型），不但能清除 O2-·等氧自由基，也可與GPx 協(xié)同阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)還有抗纖維化的作用。Nieto 等［15］報(bào)道，HSC 活化后可表達(dá)細(xì)胞色素P450E1 調(diào)節(jié)ROS 產(chǎn)物，從而誘導(dǎo) COLI 表達(dá)，而維生素 E處理過的細(xì)胞能破壞細(xì)胞色素P450E1；其他研究也發(fā)現(xiàn)維生素E 可降低α-SMA 表達(dá)，使膠原或四氯化碳損傷細(xì)胞中的蛋白質(zhì)與MDA 形成加合物，表明它在機(jī)體抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為陽性對照。

結(jié)果表明，纈草萜內(nèi)酯 A（400、300、200 μg／mL）、纈草萜內(nèi)酯 B（400、300、200、100 μg／mL）、纈草萜內(nèi)酯C（400、300、200、100、50 μg／mL）對 HSC-T6 增殖均有一定抑制作用，并呈劑量依賴性；除50 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯A、B 外，其他不同質(zhì)量濃度成分均有抗氧化作用，也呈劑量依賴性；成分質(zhì)量濃度越高時(shí)，SOD 活性越高，MDA 水平越低；400 μg／mL 纈草萜內(nèi)酯 C 的抗氧化作用強(qiáng)于50 μmol／L維生素 E。

綜上所述，纈草萜內(nèi)酯可抑制肝星狀細(xì)胞增殖，并對機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定保護(hù)作用，但該成分對肝纖維化的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。