李海艷，遲艷飛

（1.白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000；2.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130000）

心血管疾病發(fā)病率、死亡率高，嚴(yán)重威脅人類健康，而心肌缺血是心血管疾病最常見的致病因素之一［1］，當(dāng)心肌缺血發(fā)生時(shí)，臨床上大多采用溶栓或心臟搭橋等手段使血管再通，恢復(fù)心臟血流供應(yīng)，即為心肌缺血再灌注［2］，但大量研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)迅速恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)會(huì)使缺血性心肌損傷加重，出現(xiàn)心臟衰竭、心肌梗死面積增大、心律失常等更嚴(yán)重的病理現(xiàn)象，被稱為心肌缺血再灌注損傷［3］，故改善心肌缺血再灌注損傷類藥物的研究開發(fā)將對心肌缺血患者的治療具有重要意義。

HMGB1 為非組織核蛋白，高度保守，在真核細(xì)胞的胞核內(nèi)廣泛存在，在正常生理狀態(tài)下具有核結(jié)合蛋白的作用，而在病理狀態(tài)下可通過被動(dòng)釋放和主動(dòng)分泌的方式從細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞間隙，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)［4］。作為一種新型的促炎因子，HMGB1 在心肌缺血再灌注損傷進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，并與 TNF-α、IL-6 和 iNOS 等炎癥因子存在交叉聯(lián)系［5］。

遠(yuǎn)志始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，具有安神益智、消腫、祛痰之功效，臨床上主要用于治療乳房腫痛、瘡瘍腫毒、咳痰不爽、神志恍惚、健忘驚悸等癥［6］，遠(yuǎn)志皂苷為其主要活性成分，具有抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶、抗腫瘤等多種藥理作用［7-9］，近期研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，它對大鼠、鼠的心肌缺血再灌注損傷均具有明顯保護(hù)作用，可通過抗心肌細(xì)胞凋亡、抗氧化等機(jī)制發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)將在明確遠(yuǎn)志皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，探討該成分對炎癥反應(yīng)及HMGB1 表達(dá)的影響，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥 遠(yuǎn)志皂苷（含有量＞95%），批號20160514，由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供。尼莫地平（規(guī)格20 mg／片），由廣東隆信制藥有限公司生產(chǎn)，批號151120；CPK、LDH 檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；TNF-α、IL-6、iNOS 檢測試劑盒購自北方生物技術(shù)研究所；HMGB1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體分別購自英國Abcam 公司、北京華肽先鋒生物科技有限公司。

1.2 儀器 BIOPAC 多導(dǎo)（16 道）生理記錄儀，購自北京普升達(dá)科貿(mào)有限公司；DW-3000 小動(dòng)物人工呼吸機(jī)，購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；WD-2102A 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，購自北京六一儀器廠；7600S 紫外-可見分光光度計(jì)，購自上海菁華科技儀器有限公司；蛋白垂直電泳系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 動(dòng)物 清潔級SD 大鼠，購自北京維通利華公司，許可證號 SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、尼莫地平（21.6 mg／kg）組及遠(yuǎn)志皂苷高（80 mg／kg）、低（40 mg／kg）劑量組，每組 10 只，腹腔注射給藥，1 次／d，給藥體積均為 0.2 mL／100 g，其中假手術(shù)組、缺血再灌注組大鼠腹腔注射等體積溶劑，給藥周期14 d。

2.2 模型制備及心臟功能檢測 于末次給藥30 min 后開始造模，腹腔注射2%戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，氣管插管后連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)（潮氣量1.5～2 mL／100 g，頻率48～54 次／min）。小心分離右頸總動(dòng)脈，在左心室內(nèi)插管，切口處位于胸骨正中，左緣3～4 肋間位置處開胸，暴露心臟，使心包膜完全打開。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均在左心耳后左冠狀動(dòng)脈前降支下的位置處穿0 號線，結(jié)扎30 min 后進(jìn)行120 min 再灌注，生理記錄儀檢測各組大鼠缺血后、再灌注后LVEDP 和LVSP，評價(jià)心臟功能。

2.3 心肌梗死面積測定 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法結(jié)合Image Pro-Plus 軟件計(jì)算梗死面積和缺血區(qū)面積，心梗面積=梗死面積／缺血區(qū)面積×100%。

2.4 CPK、LDH 活性及 TNF-α、IL-6、iNOS 水平 缺血30 min 再灌注120 min 后，大鼠頸總動(dòng)脈采血，常規(guī)方法分離血清，酶聯(lián)免疫法檢測CPK、LDH 活性，分光光度法檢測 TNF-α、IL-6、iNOS 水平。

2.5 HMGB1 表達(dá)檢測 缺血30 min 再灌注 120 min 后，立即取大鼠左心室缺血區(qū)心肌組織100 mg，磷酸鹽緩沖液漂洗后加入組織裂解液，冰上裂解30 min，離心后二喹啉甲酸（BCA）法測定總蛋白含由量。取總蛋白20 μg，進(jìn)行12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜、封閉后依次加入 HMGB1（1 ∶500）、GAPDH 多克隆抗體（1 ∶2 000）、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，通過 HMGB1 條帶、內(nèi)參 GAPDH 條帶灰度值的比值進(jìn)行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 15.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示；組間兩兩比較采用 SNK-q 法，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 遠(yuǎn)志皂苷對大鼠心臟功能的影響 表1顯示，缺血30 min、再灌注180 min 后與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組LVEDP顯著升高（P＜0.05），LVSP顯著降低（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，尼莫地平組、遠(yuǎn)志皂苷組LVEDP顯著降低（P＜0.05），LVSP顯著升高（P＜0.05）。

表1 遠(yuǎn)志皂苷對大鼠心臟功能的影響［mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），， n=10］

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05；—表示無

組別 劑量／（mg·kg-1）LVSP缺血30 min 再灌注180 min 缺血30 min 再灌注180 min LVEDP假手術(shù)組 — 7.51±1.54 5.76±0.84 115.34±13.23 118.15±12.28缺血再灌注組 — 36.72±5.26? 34.32±5.77? 52.80±8.65? 67.02±7.61?尼莫地平組 21.6 20.56±4.74# 14.85±2.85# 80.86±10.46# 95.64±11.30#遠(yuǎn)志皂苷高劑量組 80 24.67±4.13# 19.41±3.31# 76.92±9.28# 83.53±9.38#遠(yuǎn)志皂苷低劑量組 40 29.48±3.82# 24.17±2.24# 72.79±10.62# 74.51±8.77#

3.2 遠(yuǎn)志皂苷對心肌梗死面積及 CPK、LDH 活性的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，尼莫地平組、遠(yuǎn)志皂苷組其面積明顯減少（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組 CPK、LDH 活性顯著增加（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，尼莫地平組、遠(yuǎn)志皂苷組兩者活性顯著降低（P＜0.05）。

表2 遠(yuǎn)志皂苷對心肌梗死面積及CPK、LDH 活性的影響（， n=10）

表2 遠(yuǎn)志皂苷對心肌梗死面積及CPK、LDH 活性的影響（， n=10）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05；—表示無

組別 劑量／（mg·kg-1）心肌梗死面積／% CPK／（U·mL-1）LDH／（U·mL-1）假手術(shù)組 — 4.45±0.82 93.38±12.95 168.03±18.54缺血再灌注組 — 20.08±4.60? 131.35±17.56? 293.24±36.52?尼莫地平組 21.6 9.63±2.27# 106.63±14.32# 196.62±24.29#遠(yuǎn)志皂苷高劑量組 80 12.89±2.84# 110.27±13.68# 212.43±23.60#遠(yuǎn)志皂苷低劑量組 40 16.26±3.61# 117.10±12.45# 240.85±31.36#

3.3 遠(yuǎn)志皂苷對 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影響 表3顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組 TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著升高（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，尼莫地平組、遠(yuǎn)志皂苷組三者水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 遠(yuǎn)志皂苷對 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影響（， n=10）

表3 遠(yuǎn)志皂苷對 TNF-α、IL-6、iNOS 水平的影響（， n=10）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05；—表示無

組別 劑量／（mg·kg）TNF-α／（pg·mL）IL-6／（pg·mL）iNOS／（pg·mL-1）-1-1-1假手術(shù)組 — 18.23±2.47 26.92±4.59 9.71±2.51缺血再灌注組 — 310.30±40.92? 771.60±85.23? 74.63±10.22?尼莫地平組 21.6 88.24±13.10# 153.89±19.42# 14.26±2.43#遠(yuǎn)志皂苷高劑量組 80 123.97±15.71# 204.78±25.56# 26.62±3.91#遠(yuǎn)志皂苷低劑量組 40 181.06±21.48# 385.62±42.55# 33.23±5.39#

3.4 遠(yuǎn)志皂苷對 HMGB1 表達(dá)的影響 表4、圖1顯示，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組HMGB1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，尼莫地平組、遠(yuǎn)志皂苷組其表達(dá)顯著降低，（P＜0.05），并呈劑量依賴性。

表4 遠(yuǎn)志皂苷對HMGB1 表達(dá)的影響（， n=10）

表4 遠(yuǎn)志皂苷對HMGB1 表達(dá)的影響（， n=10）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05

組別 劑量／（mg·kg-1）HMGB1／GAPDH假手術(shù)組 — 0.23±0.04缺血再灌注組 — 0.81±0.07?尼莫地平組 21.6 0.32±0.05#遠(yuǎn)志皂苷高劑量組 80 0.44±0.06#遠(yuǎn)志皂苷低劑量組 40 0.57±0.06#

圖1 各組大鼠HMGB1 表達(dá)

4 討論

心肌缺血再灌注損傷可引起心臟功能障礙、心肌梗死面積擴(kuò)大、生化代謝指標(biāo)異常等［12］現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠缺血30 min、再灌注180 min后，LVEDP 升高、LVSP 降低，同時(shí)心肌梗死面積及血清CPK、LDH 活性均明顯增加，表明建模成功；遠(yuǎn)志皂苷組LVEDP 升高，LVSP 降低，同時(shí)心肌梗死面積，血清 CPK、LDH 活性明顯減少，表明該成分對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有一定保護(hù)作用，與鄭璐、郭健龍等報(bào)道一致［10-11］。

炎癥因子釋放與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［13］，心肌缺血再灌注后，TNF-α、IL-6 等大量炎癥因子釋放入血，使中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，導(dǎo)致再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象，反饋性地生成大量氧自由基，最終引起缺血再灌注損傷［14］。iNOS 在正常生理狀態(tài)下活性較低，而當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注時(shí)，包括TNF-α、IL-6 在內(nèi)的多種炎癥因子表達(dá)上調(diào)，從而促使巨噬細(xì)胞內(nèi)分泌大量iNOS，最終引起或加劇心肌缺血再灌注損傷程度［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志皂苷預(yù)處理能通過降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α、IL-6、iNOS 水平來減輕心肌缺血再灌注損傷，表明該成分對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)可能與減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

機(jī)體從巨噬細(xì)胞、凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞中釋放HMGB1后，可作為早期炎癥反應(yīng)促進(jìn)因子來上調(diào) TNF-α、IL-6、iNOS 等炎癥因子的表達(dá)，它們與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)［16］。研究表明，丹參酮ⅡA 預(yù)處理可通過抑制心肌缺血再灌注來引起ROS 增加，從而降低HMGB1 表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)發(fā)生，最終起到對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與丹參酮ⅡA 作用機(jī)制類似，遠(yuǎn)志皂苷組HMGB1 表達(dá)也明顯降低，表明該成分也可通過抑制HMGB1 表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)的保護(hù)作用。

綜上所述，遠(yuǎn)志皂苷具有保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與減少炎癥反應(yīng)、抑制HMGB1 表達(dá)有關(guān)。