王 森，歐水平，陳 莉，呂佳佳，王治凱，熊永愛(ài)?

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，貴州 遵義 563099）

鼻寧噴霧劑是由鵝不食草、一枝黃花經(jīng)水提醇沉而制得的鼻科苗藥獨(dú)家品種，具有疏風(fēng)解表、清熱通竅之功效，臨床主要用于急性、慢性單純性和過(guò)敏性鼻炎治療［1-2］。研究表明，鼻炎和鼻竇炎發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，前者是指以鼻腔黏膜炎癥為特征的病癥；后者是指以鼻竇黏膜炎癥為特征的病癥，常繼發(fā)于前者，在大多數(shù)個(gè)體中兩者通常共存，故鼻-鼻竇炎是指以鼻腔和鼻竇黏膜炎癥為特征的病癥，治療時(shí)先以藥物控制鼻腔和鼻竇炎癥至關(guān)重要［3-4］。但目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)鼻寧噴霧劑用于治療鼻竇炎的報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)研究該制劑對(duì)急性鼻竇炎大鼠的治療作用，從而為其鼻科適應(yīng)癥的拓展奠定基礎(chǔ)，對(duì)拓展其臨床適應(yīng)證、擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)品種的市場(chǎng)占有率也具有重要意義。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí) SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量 180～220 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（渝）2010-0005。

1.2 試藥 鵝不食草、一枝黃花購(gòu)自貴州省畢節(jié)市玲源中藥材行，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院楊建文老師鑒定分別為鵝不食草Centipeda minima（L.）A.Br.et Aschers.、一 枝 黃 花Solidago decurrensLour.的干燥全草。丙酸氟替卡松鼻噴霧劑（批號(hào)H20091100，英國(guó)葛蘭素史克公司）。大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào) ADI-900-086A）、IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)ADI-900-045）（欣博盛生物科技有限公司）。綠原酸、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)分別為 110753-201415、100080-201409，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；異綠原酸A 對(duì)照品（批號(hào)151028，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為重蒸水。

1.3 儀器 Agilent 1260 液相色譜儀，配置 DAD 檢測(cè)器（美國(guó) Agilent 公司）；BT125D 電子天平（德國(guó) Sartorius 公司）；JA1002 電子天平（上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司）；98-II-B 磁力攪拌電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Exceed-Cd-20 實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都艾科水處理設(shè)備有限公司）；MK3 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher 公司）；BA200 Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 噴霧劑制備 取鵝不食草120 g、一枝黃花500 g，加水浸潤(rùn)12 h，水蒸氣蒸餾，收集芳香水約為藥材的3 倍量，藥渣加水蒸煮 3 次，第 1 次 2 h，第 2、3 次各 1.5 h，合并煎煮，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為 1.15（60 ℃）的清膏。芳香水加10 g 聚山梨酯 80，加入清膏，攪勻，加 9 g氯化鈉調(diào)節(jié)等滲后加入山梨酸，用磷酸氫二鈉調(diào)pH 至4.0～6.0，加水至 1 000 mL，攪勻，靜置，取上清液，按每瓶 10 mL 灌裝至噴瓶中，即得［1］。

2.2 綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 含有量測(cè)定

2.2.1 溶液制備 精密稱取綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 對(duì)照品適量，50%甲醇制成每1 mL 分別含三者140、403.6、322.56 μg 的對(duì)照品溶液。將噴霧劑用 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.2 色譜條件［5］Neptune C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～25 min，15%～20%A；25～55 min，20%～35%A；55～65 min，35%～10%A）；體積流量 1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 326 nm；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.3 線性關(guān)系考察 取 “2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，50%甲醇逐級(jí)2 倍稀釋，在 “2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸。

2.2.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 在 “2.2.2”項(xiàng)色譜條件下，取同一供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定6 次，考察精密度；于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，考察穩(wěn)定性；取同一批噴霧劑，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察重復(fù)性。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取綠原酸、蘆丁、異綠原酸 A 含有量已知的噴霧劑6 份，每份2 mL，置于 10 mL 量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液適量，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，按 “2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.2.6 樣品含有量測(cè)定 取噴霧劑，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量。

2.3 模型建立 依據(jù)Ge 等［6］報(bào)道的方法并加以改進(jìn)，取大鼠70 只，腹腔注射鹽酸氯胺酮 0.5 mg／kg，必要時(shí)用一般劑量重復(fù)1 次，進(jìn)行全麻；鹽酸利多卡因20 mg／mL 加腎上腺素0.125 mg，進(jìn)行鼻背下注射麻醉，剃毛，碘伏消毒備皮，在鼻中線上中 1／3 交界處旁開(kāi) 3 mm，以 45°進(jìn)針1.5 mm，置石蠟適量于內(nèi)封口，然后塞入適量帶有金黃色葡萄球菌的明膠海綿于內(nèi)，由于是微創(chuàng)，不必縫合，上述過(guò)程在顯微鏡下操作以確保操作準(zhǔn)確性，以噴嚏、流涕、鼻腔分泌物等為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷模型成功與否。

2.4 分組與給藥 取造模成功的大鼠50 只，按體質(zhì)量和鼻竇炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（≥6 分）隨機(jī)分為 5 組，每組 10 只，分別為模型組（生理鹽水）、陽(yáng)性組（40 μg／kg 丙酸氟替卡松鼻噴霧劑）、鼻寧噴霧劑高劑量組（0.182 g／kg）、鼻寧噴霧劑中劑量組（0.091 g／kg）、鼻寧噴霧劑低劑量組（0.045 5 g／kg），另取 10 只正常大鼠作為正常組，各組通過(guò)鼻腔滴鼻給藥，2 次／d（早晚各 1 次），連續(xù) 14 d。第 15天，大鼠股動(dòng)脈取血，3 000 r／min 離心 10 min，收集上清液，-20 ℃保存待測(cè)，再斷頸處死大鼠，剖取鼻竇黏膜（手術(shù)刀劃取左側(cè)竇口1 mm×1 mm 黏膜）。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 鼻部外觀體征及鼻竇炎癥狀評(píng)分 造模、給藥后，觀察大鼠鼻部癥狀和體征，主要包括鼻癢、噴嚏、流涕等，分別與給藥前后觀察記錄各實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻竇炎癥狀，并按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分［7］。

表1 鼻竇炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.5.2 鼻竇黏膜病理組織學(xué)檢查 將大鼠鼻竇黏膜組織按病理檢驗(yàn) SOP 程序進(jìn)行脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢。數(shù)碼3 目攝像顯微攝像系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40 倍下觀察全部組織大體病變，再采集100、400 倍圖片觀察具體病變。

2.5.3 血清TNF-α、IL-6 水平測(cè)定 取大鼠股動(dòng)脈血液，3 000 r／min 離心 10 min，取上清液，ELISA 法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6 水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間采用單因素方差分析，方差齊者進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行 Tamhane’s T2 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有顯著性差異；等級(jí)資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用 Nemenyi 檢驗(yàn)，α=0.05，以P＜0.05 為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察與含有量測(cè)定 HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。綠原酸、蘆丁、異綠原酸A 回歸方程分別為Y=28.277 2X＋621.641 7（r= 1.000 0）、Y= 11.075 8X-3.900 0（r=1.000 0）、Y=38.258 7X-415.087 5（r=0.999 3），線性范圍 分 別 為 8.75～140、25.225～403.6、20.16～322.56 μg／mL。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的 RSD 均未超過(guò)0.57%（n=6），供試品在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；平均加樣回收率97.76%～101.74%，RSD≤2.08%（n=6）。綠原酸、蘆丁、異綠原酸 A 含有量分別為 24.75、133.06、71.31 μg／mL，符合鼻寧噴霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.2 外觀體征、鼻竇炎評(píng)分、病理?yè)p傷評(píng)分 除正常組外各組大鼠造模后均抓撓鼻、面不止，到處摩擦、打噴嚏，有鼻涕流出，治療10 d 后明顯好轉(zhuǎn)；與模型組比較，給藥組大鼠打噴嚏、流鼻涕情況明顯減輕，其中鼻寧噴霧劑給藥高劑量組、陽(yáng)性組整體狀態(tài)最好。表2顯示，造模后各組鼻竇炎評(píng)分較造模前顯著升高（P＜0.01），而給藥后鼻寧噴霧劑組該評(píng)分較模型組顯著降低（P＜0.05）。

圖2顯示，模型組大鼠鼻竇黏膜組織黏膜上皮和固有層排列、分界清晰，黏膜層和黏膜下層分界不清，黏膜層顯著增厚，黏膜上皮細(xì)胞脫落或潰爛，黏膜層和黏膜下層大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中包括較多的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；鼻寧噴霧劑組大鼠黏膜上皮和固有層排列、分界清晰，纖毛上皮排列整齊，偶見(jiàn)有個(gè)別組織內(nèi)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。再對(duì)大鼠鼻竇黏膜組織炎性損傷情況按文獻(xiàn)［8］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表2，可知與正常組比較，模型組大鼠鼻竇黏膜組織炎性病變顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，鼻寧噴霧劑組大鼠其炎性損傷顯著減少（P＜0.05）。

表2 鼻寧噴霧劑對(duì)大鼠鼻竇炎評(píng)分與鼻竇黏膜組織炎性損傷評(píng)分的影響（， n=10）

表2 鼻寧噴霧劑對(duì)大鼠鼻竇炎評(píng)分與鼻竇黏膜組織炎性損傷評(píng)分的影響（， n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05

組別 鼻竇炎評(píng)分給藥前 給藥后 鼻竇黏膜組織炎性損傷評(píng)分正常組 0.13±0.012 0.11±0.015 1.39±0.51模型組 7.48±0.37△△ 7.23±0.56△△ 12.68±3.81△△陽(yáng)性組 7.52±0.61△△ 2.68±0.19? 5.76±0.21?鼻寧噴霧劑高劑量組 7.29±0.78△△ 2.12±0.15? 5.40±0.63?鼻寧噴霧劑中劑量組 7.67±0.43△△ 2.09±0.16? 6.20±0.83?鼻寧噴霧劑低劑量組 7.44±0.36△△ 2.87±0.19? 7.60±0.82?

圖2 各組大鼠鼻竇黏膜組織病理學(xué)變化（HE，×400）

3.3 TNF-α、IL-6 水平 表3顯示，與正常組比較，模型組 TNF-α、IL-6 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鼻寧噴霧劑兩者水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 鼻寧噴霧劑對(duì)TNF-α、IL-6 水平的影響（，n=10）

表3 鼻寧噴霧劑對(duì)TNF-α、IL-6 水平的影響（，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 TNF-α／（pg·mL-1）IL-6／（pg·mL-1）正常組 9.96±1.14 8.43±2.84模型組 23.18±3.32△△ 18.43±3.12△△陽(yáng)性組 13.31±2.56?? 8.91±2.15?鼻寧噴霧劑高劑量組 14.18±2.13?? 8.97±2.34??鼻寧噴霧劑中劑量組 15.69±2.85?? 11.24±2.41?鼻寧噴霧劑低劑量組 17.32±1.92? 13.19±1.97?

4 討論

鼻竇炎是耳鼻喉科多發(fā)病，我國(guó)發(fā)病率為8%～15%，且極易復(fù)發(fā)，難以治愈，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與感染、纖毛功能不良、變態(tài)反應(yīng)、環(huán)境因素、細(xì)菌生物膜等多種因素有關(guān)。目前，鼻竇炎的治療仍以鼻內(nèi)鏡外科手術(shù)及抗炎藥物為主，存在創(chuàng)傷性大、復(fù)發(fā)率高、抗生素和糖皮質(zhì)激素耐藥性與不良反應(yīng)等一系列問(wèn)題［9-10］。

鼻腔外側(cè)壁存在著1 個(gè)不穩(wěn)定組織微環(huán)境，能在誘導(dǎo)因子作用下分泌多種細(xì)胞因子，使得腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞等增殖，并激活嗜酸性粒細(xì)胞等分泌炎性介質(zhì)，從而導(dǎo)致鼻竇炎發(fā)生［11］，其中 TNF-α、IL-6 是公認(rèn)的與局部炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子，對(duì)鼻竇炎發(fā)生發(fā)展及病理變化有著直接而重要的影響［12-13］。其中，TNF-α 是初級(jí)炎性因子，具有多種促炎生物活性，能有效誘導(dǎo)包括自身在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，并活化各種炎性細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附白細(xì)胞，導(dǎo)致白細(xì)胞在炎性反應(yīng)部位聚集，并促進(jìn)血管通透性顯著性增加，從而加重炎癥損傷［14］；感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展與IL-6 升高有著密切關(guān)系，它是具有促進(jìn)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，可增強(qiáng)炎癥介質(zhì)對(duì)組織的損害，可通過(guò)P13 K／Akt 信號(hào)通路選擇性激活 GSK3β 而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠感染鼻竇炎后可引起血液異常分泌TNF-α、IL-6 等促炎因子，導(dǎo)致促炎因子、抑炎因子平衡被打破，使得后者分泌相對(duì)不足，鼻竇產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)；鼻寧噴霧劑可明顯抑制上述促炎因子分泌，減少鼻竇黏膜組織炎性損傷，從而對(duì)大鼠鼻竇炎癥狀產(chǎn)生治療效果，可為拓展該制劑新適應(yīng)癥、實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用價(jià)值最大化提供理論依據(jù)。