鄒獻(xiàn)亮，陳 颋，華 臘，王永麗，侴桂新

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203）

熟地黃為生地黃的炮制加工品，具有補(bǔ)血滋陰、益精填髓功效［1］。地黃中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、紫羅蘭酮類、糖類等成分［2］，目前有關(guān)地黃含有量測(cè)定的指標(biāo)主要有地黃苷類成分［3-4］、梓醇［5-6］，熟地黃中主要有還原糖［7］、5-羥甲基糠醛［8-9］以及核苷類成分［10］等。研究表明熟地黃在炮制過(guò)程中，主要化學(xué)成分會(huì)產(chǎn)生的變化，如地黃從鮮品加工成生地黃及熟地黃，梓醇的含有量降低至原來(lái)的 1／10［11］。苯乙醇苷類成分是地黃中主要活性成分之一，毛蕊花糖苷為其代表，該類成分具有抗氧化、自由基清除、抗腫瘤、神經(jīng)元保護(hù)、肝臟保護(hù)、止痛、抗病毒、抗菌等多種生物活性［12］，且在地黃的加工炮制過(guò)程中是較為穩(wěn)定的一類化合物，可更好地體現(xiàn)其質(zhì)量傳遞規(guī)律，可作為地黃加工炮制生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制指標(biāo)。但單一檢測(cè)毛蕊花糖苷的含有量，受不同炮制方法影響，不同批次熟地黃中的含有量差異較大［13-14］，很多批次難以達(dá)到0.02%的規(guī)定。因此本實(shí)驗(yàn)選擇以毛蕊花糖苷為內(nèi)參物，建立同時(shí)測(cè)定洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 的一測(cè)多評(píng)法（QAMS）。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國(guó)Waters 公司e2695 型液相色譜儀（美國(guó) Waters 公司，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測(cè)器、工作站）；Agilent 1200 高效液相系統(tǒng)、Agilent 1100 高效液相系統(tǒng)包括工作站（美國(guó)Agilent 公司）；MG Ⅱ C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；Thermo C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 材料 對(duì)照品毛蕊花糖苷自制（含有量96.6%）、洋地黃葉苷 C 自制（含有量 96.9%）、焦地黃苯乙醇苷A1（含有量96.5%）、焦地黃苯乙醇苷B1（含有量97.8%）。17 批熟地黃和18 批生地黃購(gòu)自成都、福州、上海等地，見(jiàn)表1～2，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定為正品。乙腈、甲酸，均為色譜純；超純水自制；其余試劑均為分析純。

表1 生地黃樣品信息Tab.1 Information of Rehmanniae Radix

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為MGⅡC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～35 min，12%～22% A；35～40 min，22%～32% B；40～45 min，32% B）；體積流量 1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 334 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫 30 ℃。此條件下，洋地黃葉苷 C、焦地黃葉苷A1、毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1 分離良好，各組分的理論塔板數(shù)均＞8 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 熟地黃樣品信息Tab.2 Information of Rehmanniae Radix Praeparae

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷 A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為 512、687.5、593.5、188.7 μg／mL 的對(duì)照品貯備液，再分別精密吸取4 個(gè)對(duì)照品貯備液各 1 mL 置于 5 mL、10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液Ⅰ和Ⅱ，精密吸取對(duì)照品溶液Ⅰ1、0.8、0.6、0.4 mL 至 5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，分別制得混合對(duì)照品溶液Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品最粗粉約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入 60% 甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流 1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用 60% 甲醇 補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 的回歸方程及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表3。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表3 熟地黃中各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents in Rehmanniae Radix Praeparae

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取熟地黃供試品溶液10 μL，在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，于同 1 天連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示，洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 峰面積積分值 RSD 分別為 0.89%、0.44%、0.34%、0.37%。精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 3 d，6 次／d，記錄峰面積，以上 4種成分的日間精密度分別為 1.07%、1.23%、0.32%、0.56%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品6 份，每份2 g，精密稱定，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得洋地黃葉苷 C、焦地黃苯乙醇苷 A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 的峰面積。計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù) RSD 分別為 1.30%、1.10%、1.37%、2.01%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、16、24、48、72 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為10 μL，測(cè)定洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 峰面積的 RSD 分別為1.08%、1.30%、0.32%、0.73%。表明供試品溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的樣品1 g，精密稱定，平行 6 份，分別按各成分質(zhì)量濃度的100%精密加入洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 對(duì)照品溶液，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。測(cè)得洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1 的平均加樣回收率分別為98.30%、99.15%、98.31%、101.88%，RSD 分別為 1.35%、1.33%、1.12%、1.19%。

2.2 QAMS

2.2.1 相對(duì)校正因子f多點(diǎn)法計(jì)算 以毛蕊花糖苷為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷 A1、焦地黃苯乙醇苷 B1 的f，分別為 0.851、0.584、0.841，RSD 分 別 為 0.49%、0.7%、0.93%，見(jiàn)表4。

2.2.2f斜率法計(jì)算 根據(jù)線性方程，分別計(jì)算洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷 B1 的f，分別為 0.854、0.580、0.843。

表4 熟地黃中其他3種成分的相對(duì)校正因子Tab.4 Relative correction factor of three other components in Rehmanniae Radix Praeparata

2.2.3 待測(cè)組分色譜峰定位 利用相對(duì)保留時(shí)間（rk／s，k為待測(cè)組分，s 為對(duì)照物）定性，測(cè)得洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷 B1 的rk／s，分別為 0.546、0.746、1.056，RSD分別為 0.07% 、0、0，見(jiàn)表5。

表5 熟地黃中其他3種成分的相對(duì)保留時(shí)間Tab.5 Relative retention time of three other components in Rehmanniae Radix Praeparata

2.2.4f重現(xiàn)性考察 實(shí)驗(yàn)考察了Agilent 1100、Agilent 1200、Waters 型3種高效液相色譜系統(tǒng)和Diamonsil（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Thermo（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、MGⅡ（250 mm ×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱。結(jié)果表明，各種條件下所得 RSD＜5.0%，分離效果比較理想，見(jiàn)表6。

表6 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察Tab.6 Reproducibility of relative correction factors

利用rk／s進(jìn)行色譜峰的定位，結(jié)果顯示，在不同色譜柱下rk／s波動(dòng)較小，測(cè)定得到rk／sRSD 值均小于3%，表明在不同色譜柱下，rk／s的重現(xiàn)性良好，見(jiàn)表7。

表7 不同儀器和色譜柱測(cè)得rk／sTab.7 rk／s value determined by different instruments and columns

2.3 QAMS 和外標(biāo)法（ESM）比較 按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備17 批熟地黃樣品和18 批生地，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液Ⅱ、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算地黃中洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷 A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷 B1 的含有量，結(jié)果見(jiàn)表 8～9。將 2種方法所得含有量經(jīng)SPSS 軟件采用t檢驗(yàn)分析二者差異，結(jié)果表明，在熟地黃中，2 組數(shù)據(jù)洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷B1P值分別為 0.958、0.961、0.997，均大于 0.05；在生地黃中2 組數(shù)據(jù)洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷 B1P值分別為 0.998、0.970、0.926，均大于 0.05。故各成分外標(biāo)法實(shí)測(cè)值與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值間無(wú)顯著差異。表明QAMS 法用于地黃藥材的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的。

表8 QAMS 與ESM 測(cè)定熟地黃中4種成分含有量比較Tab.8 Comparison of contents of four components in Rehmanniae Radix Praeparata by QAMS and ESM

表9 QAMS 與 ESM 測(cè)定生地黃中4種成分含有量比較Tab.9 Comparison of contents of four components in Rehmanniae Radix by QAMS and ESM

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用QAMS 建立了地黃中4 個(gè)苯乙醇苷成分同時(shí)測(cè)定的方法。毛蕊花糖苷易得、化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，而且在地黃植物中含有量很高，2015版 《中國(guó)藥典》 中生地黃和熟地黃HPLC 含有量測(cè)定都采用毛蕊花糖苷作為指標(biāo)成分，因而本實(shí)驗(yàn)選擇毛蕊花糖苷作為內(nèi)參物。這4 個(gè)苯乙醇苷類成分最大紫外吸收都為 334 nm，因此選擇334 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在毛蕊花糖苷與洋地黃葉苷C、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷B1 的相對(duì)校正因子的評(píng)價(jià)中，經(jīng)查閱文獻(xiàn)［15-17］，實(shí)驗(yàn)考察了不同進(jìn)樣濃度、色譜柱、液相色譜儀、柱溫、體積流量、流動(dòng)相 pH 值的影響。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下相對(duì)校正因子具有很好的重現(xiàn)性。對(duì)色譜峰定位中，采用相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合紫外吸收光譜，增加準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)選取了不同來(lái)源的17 批熟地和18 批生地藥材進(jìn)行比較，結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法在地黃中4種苯乙醇苷類成分的測(cè)定中無(wú)顯著差異。17 批熟地4種苯乙醇苷物質(zhì)含有量總和在0.04%～0.2%之間，18 批生地4種苯乙醇苷成份在0.045%～0.25%范圍內(nèi)。其中熟地前3批由前3 批生地黃加工炮制而成，結(jié)果表明地黃經(jīng)炮制后4種苯乙醇苷成分含有量有所下降，與張波泳等［18］所報(bào)道的一致。本實(shí)驗(yàn)建立的 QAMS 為地黃的質(zhì)量控制提供了新方法。