李曉芳，田穎超，董 乾，耿文躍，宋小妹，羅都強?

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

異色擬盤多毛孢Pestalotiopsis versicolor是紅樹植物的內(nèi)生真菌［1］。紅樹植物生長在海洋和陸地之間，為適應(yīng)高鹽、潮汐環(huán)境，其可能含有結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的化學(xué)物質(zhì)。這類植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌，也具有獨特的物種分布和代謝途徑，代謝產(chǎn)物也有著較強的多樣性。近年來，從紅樹植物內(nèi)生真菌中分離得到一批骨架新穎的化合物，活性包括抗菌、抗腫瘤、抗氧化等［2-5］。但業(yè)內(nèi)對異色擬盤多毛孢的相關(guān)研究還在起步階段，因此本研究對其固體發(fā)酵產(chǎn)物進行分離，鑒定其次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)并測定化合物的生物活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker AM-600 型核磁共振儀、APEX-ulltra 7.0T 型質(zhì)譜儀（德國 Bruker 公司）；Shimadzu UV-210 型紅外光譜儀（日本Shimadzu 公司）；Perkin-Elmer 577 型紫外光譜儀（美國Perkin-Elmer 公司）；BSZ-100 型自動部分收集儀（上海青浦滬西儀器廠）；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海飛越儀器有限公司）；ZHWY 型雙層恒溫搖床（上海智城分析儀器有限公司）；R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 Buchi 公司）；DLSB-5／20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；ZF7 三用紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；UV-210 型紫外可見分光光度計（杭州陸恒生物科技有限公司）。電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；ZHJH-C112C 型超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司）；BSA224S 型電子天平（德國 Sartorius 公司）；FLUOstar OPTIMA 型酶聯(lián)免疫檢測儀（德國BMG Labtech 公司）；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海飛越實驗儀器有限公司）。96 孔板（美國Costar 公司）；GF254型薄層層析硅膠（30 mm×100 mm）、薄層層析硅膠板（200 mm×200 mm）購自青島海洋化工廠分廠；柱層析硅膠（200～300 目，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；拌樣硅膠（60～80 目，青島永海硅膠有限公司）；MCI GEL CHP 20SS 購自日本三菱公司；ODSC18（德國 Merck 公司）。HPLC、NMR、MS 和紅外、紫外分析試劑是色譜純；其他試劑均為分析純。DMSO、磷酸緩沖液、PNPG（4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷）、阿卡波糖、Na2CO3等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 材料

1.2.1 菌株 本研究的異色擬盤多毛孢菌株由浙江大學(xué)張敬澤教授提供并鑒定為正品，本實驗室保藏。

1.2.2 培養(yǎng)基 改良 PD 培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200.0 g，加入 1 000.0 mL 無菌水煮沸并過濾。加入葡萄糖20.0 g，經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃、濕熱滅菌20.0 min，再加入瓊脂粉20.0 g。大米培養(yǎng)基為大米 80.0 g，加入 100.0 mL 無菌水，密閉封口浸泡12 h，經(jīng)高壓滅菌鍋 121 ℃、濕熱滅菌 20.0 min。

2 提取與分離

將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到cPDA 液體培養(yǎng)基中；然后將其放于搖床上，28 ℃，150 r／min 的條件下恒溫培養(yǎng)7 d，制成3 L種子液；最后將種子液以10%的接種量接種到準(zhǔn)備好的大米固體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下在恒溫箱中發(fā)酵33 d。

在固體發(fā)酵產(chǎn)物中加入等體積的乙酸乙酯，攪拌均勻。浸泡萃取后，得到萃取液。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液進行蒸餾濃縮得到部分浸膏。將上述過程重復(fù)3～4 次，共得到浸膏60 g。

將浸膏與柱層析硅膠（60～80 目）以 1 ∶1.5的比例混合拌樣得到粗樣。用硅膠柱層析（200～300 目）方法進行分離。粗分，用石油醚 ∶乙酸乙酯（19 ∶1、9 ∶1、6 ∶1、4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1）進行梯度洗脫，得到6 個組分（Fr.1-6）。再將所得6個組分反復(fù)硅膠柱層析分離，結(jié)合制備薄層層析、Sephadex LH-20 得到單體化合物［6］。這 6 個部分再分別用硅膠柱分離，用石油醚 ∶乙酸乙酯（19 ∶1、9 ∶1、6 ∶1、4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1）梯度洗脫，得到6 個部分。

再將得到的6 個部分上硅膠柱，如此重復(fù)2～3次，然后用凝膠及重結(jié)晶的方法反復(fù)純化。Fr.4部分得到化合物 4（20 mg）、5（20 mg）、6（20 mg）；Fr.3 部分得到化合物 1（12 mg）、2（14 mg）；Fr.2 部分得到化合物 3（14 mg）、7（20 mg）、8（8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色晶體（甲醇），含有量 94%，LRESIMSm／z：181.08［M ＋ H］＋（計算值181.09），推測分子式 C10H12O3。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.94（3H，s，H-10），2.76（2H，t，J=7.2 Hz，H-5），4.15（2H，t，J=7.2 Hz，H-3），6.7（1H，d，J=8.52 Hz，H-5），6.7（1H，d，J= 8.52 Hz，H-9），7.01（1H，d，J=8.52 Hz，H-8），7.01（1H，d，J= 8.52 Hz，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：175.7（C-1），159.5（C-4），133.6（C-6），132.6（C-7），119.0（C-5），134.8（C-8），119.0（C-9），69.3（C-3），37.8（C-2），23.7（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］一致，故鑒定為3-（4-甲苯氧基）丙酸。

化合物2：白色晶體（甲醇），含有量 95%，LRESIMSm／z：139.07［M ＋ H］＋（計算值139.07），推測分子式 C8H10O2。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，d），6.72（2H，d），3.74（2H，t），2.73（2H，t）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：129.5（C-1），129.5（C-2），114.7（C-3），155.3（C-4），114.7（C-5），129.5（C-6），63.1（C-7），38.0（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］一致，故鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物3：無色粘稠液體（甲醇），含有量93% ，LRESIMSm／z：123.07［M ＋H］＋（計算值123.08），推測分子式 C8H10O。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.71（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.71（2H，t，J=7.2 Hz，H-7），3.68（2H，t，J= 7.2 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.8（s，C-1），116.2（d，C-2，6），130.9（d，C-3，5），131.1（s，C-4），39.4（t，C-7），64.6（t，C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］一致，故鑒定為2-苯乙醇。

化合物4：白色結(jié)晶（甲醇），含有量 95%，HRESIMSm／z：431.311 5［M ＋ H］＋（計算值431.311 7），推測分子式 C28H44O4。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：5.65（1H，s，H-7），5.24（1H，dd，J=15.3，6.9 Hz，H-23），5.16（1H，dd，J= 15.3，6.6 Hz，H-22），4.04（1H，m，H-3），1.02（3H，d，J=6.6 Hz，H-21），0.98（3H，s，H-19），0.92（3H，d，J=6.9 Hz，H-28），0.84（3H，d，J=6.6 Hz，H-27），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，H-26），0.61（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：26.1（C-1），30.8（C-2），67.6（C-3），37.0（C-4），79.2（C-5），197.3（C-6），119.1（C-7），164.7（C-8），76.2（C-9），42.7（C-10），28.7（C-11），34.9（C-12），45.1（C-13），51.7（C-14），22.2（C-15），27.6（C-16），55.8（C-17），12.1（C-18），20.2（C-19），40.0（C-20），21.1（C-21），135.1（C-22），132.3（C-23），45.3（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），20.0（C-27），17.5（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］一致，故鑒定為 3β，5α，9α-三羥基-（22E，24R）-麥角甾-7，22-二烯-6-酮。

化合物5：無色針晶（氯仿），含有量 93%，HRESIMSm／z：392.342 2［M ＋ H］＋（計算值392.342 6），推測分子式 C28H44O。1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：0.62（3H，s，H-18），0.83（3H，d，J=7.2 Hz，H-26），0.83（3H，d，J=7.0 Hz，H-27），0.90（3H，d，J=6.8 Hz，H-28），0.94（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J=6.5 Hz，H-21），3.63（1H，m，H-3），5.13（2H，m，H-22，23），5.32（1H，m，H-7），5.33（1H，m，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：38.4（C-1），32.1（C-2），70.4（C-3），40.2（C-4），139.8（C-5），119.8（C-6），116.2（C-7），141.4（C-8），46.2（C-9），37.3（C-10），21.2（C-11），39.2（C-12），42.9（C-13），54.2（C-14），23.7（C-15），28.1（C-16），56.0（C-17），12.0（C-18），16.2（C-19），40.5（C-20），21.3（C-21），42.8（C-24），33.2（C-25），20.1（C-26），19.6（C-27），17.5（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］一致，故鑒定為麥角甾醇。

化合物6：淺黃色晶體（氯仿），含有量94%，HRESIMSm／z：392.311 1［M ＋ H］＋（計算值392.311 3），推測分子式 C28H40O。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.62（1H，d，J=9.5 Hz，H-7），6.06（1H，d，J=9.5 Hz，H-6），5.70（1H，s，H-4），5.19（2H，m，H-22，H-23），1.26～2.59（18H，m），1.20（3H，d，J= 6.7 Hz，H-21），1.05（3H，s，H-19），0.97（3H，s，H-18），0.95（3H，d，J=6.9 Hz，H-28），0.86（3H，d，J=6.7 Hz，H-27），0.83（3H，d，J=6.7 Hz，H-26）；13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：199.5（C-3），164.3（C-8），154.0（C-16），133.3（C-22），134.1（C-7），132.2（C-23），124.7（C-5），123.5（C-6），122.9（C-4），56.6（C-17），45.4（C-9），44.8（C-13），43.8（C-10），39.7（C-20），36.8（C-10），35.4（C-12），34.4（C-1），33.8（C-2），33.3（C-25），27.5（C-16），26.3（C-15），23.5（C-21），21.4（C-26），19.6（C-27），19.1（C-18），18.7（C-11），17.2（C-28），16.6（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］一致，故鑒定為麥角甾4，6，8（14），22-四烯-3 酮。

化合物7：無色針狀結(jié)晶（氯仿），含有量98% ，HRESIMSm／z：320.120 0［M＋H］＋（計算值320.120 5），HRESIMS［M＋NH4］＋m／z：336.157 8，分子量318，且推測它可能含有氯元素。由單晶結(jié)構(gòu)可確定其立體結(jié)構(gòu)，根據(jù)鍵長可知其含有1 個氯原子。因此推測分子式為 C15H23O5Cl。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.94（3H，s，H-15），1.30（3H，s，H-11），1.46（3H，s，H-14），1.69（1H，dd，J=3.78，3.72 Hz，H-6a），1.75（3H，s，H-13），2.25（1H，t，J=2.34 Hz，H-2a），2.34（1H，dd，J=3.42，3.42 Hz，H-2b），3.10（1H，s，H-4），3.22（1H，d，J=3.24 Hz，H-6b），3.28（1H，d，J=2.46 Hz，H-1），4.09（1H，d，J=3.24 Hz，H-8），4.21（1H，m，H-7）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：20.5（C-13），23.7（C-14），24.6（C-15），29.8（C-11），37.7（C-5），40.4（C-2），42.1（C-9），41.8（C-6），55.3（C-1），61.1（C-4），70.2（C-3），68.3（C-10），72.3（C-7），72.7（C-8），175.6（C-12）。而通過碳譜、氫譜數(shù)據(jù)可確定，含有 5 個季碳、4 個叔碳、2 個仲碳、4 個伯碳，共 15 個 碳，其中1個為羧基碳。經(jīng)1H-1HCOSY 中可以看出2 和6 位的氫裂分了，并且 1-H 與 2-H 相關(guān)，11-H 與 C-3 相關(guān)，7-H 與6-H、8-H 相關(guān)，見圖1。從 HMBC 譜圖中可以看出 4-H 與 C-12、C-3、C-5 相關(guān)，C-5 與 4-H、13-H、6-H、7-H 相關(guān)，C-9 與 7-H、8-H、14-H、15-H 相關(guān)。C-10 與 1-H、14-H、15-H 相關(guān)，C-3 與 1-H、2-H、4-H、11-H 相關(guān)。而且化合物 7 的結(jié)構(gòu)與文獻［13］一致，故鑒定為（1aS，3R，4R，4aR，6S，7R，8aS）-7-chloro-3，6-dihydroxy-3，4a，8，8-tetramethyl-octahydro- 1aH-naphtho［1-b］oxirene-4-carboxylic acid。

圖1 化合物7 的主要H-H COSY 和HMBC 相關(guān)Fig.1 Key H-H COSY and HMBC correlations of compound 7

化合物 8：無色油狀（甲醇），含有量 93%，HRESIMSm／z：217.103 0［M ＋ H］＋（計算值217.103 1），推測分子式 C10H16O5。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.05（1H，m，H-9），4.15（1H，m，H-3），3.35（1H，m，H-4），2.36（1H，dd，J=17.8，6.3 Hz，H-5a），2.29（1H，dd，J=14.5，3.1 Hz，H-2a），2.63（1H，dd，J=14.5，2.0 Hz，H-2b），2.35（2H，m，H-7），2.34（1H，dd，J=17.8，6.3 Hz，H-5b），2.05（2H，m，H-8），1.27（3H，d，J=6.30 Hz，H-10）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：169.6（C-1），39.5（C-2），68.6（C-3），72.2（C-4），44.4（C-5），212.5（C-6），39.5（C-7），32.6（C-8），73.2（C-9），18.2（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］一致，故鑒定為cepharosporolides G。

4 活性測試

以PNPG 法測定化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。405 nm 測 OD 值，每孔重復(fù)做 3 次，以阿卡波糖作為陽性對照。實驗設(shè)4 個組分別為 Ac（空白組）、Acb（空白對照組）、As（樣品測定組）、Asb（樣品對照組）。抑制率計算公式為抑制率% =1-（Ac-Acb）／（As-Asb）。

本實驗檢測到乙酸乙酯粗提物對α-葡萄糖苷酶有中等抑制能力，因此檢測各化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率。見表1。

表1 各化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Tab.1 Inhibition rates of α-glucosidase activity of various compounds

化合物 1 在質(zhì)量濃度 6.25 mg／mL 時對 α-葡萄糖苷酶具有較弱的抑制活性，抑制率5.14%。

5 討論

本研究對異色擬盤多毛孢內(nèi)生真菌的固體發(fā)酵產(chǎn)物進行分離，得到8 個化合物。其中，含氯化合物7 是首次從擬盤多毛孢屬內(nèi)生真菌的固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，大環(huán)內(nèi)酯類化合物5 是首次從異色擬盤多毛孢內(nèi)生真菌的固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到。紅樹林植物及其內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌中也有分離到大環(huán)內(nèi)酯類化合物［15-17］?；衔?1 質(zhì)量濃度為6.25 mg／mL 時對α-葡萄糖苷酶具有較弱的抑制活性，可以試圖進行結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)為降糖藥物。本實驗證明了紅樹林植物及其擬盤多毛孢屬內(nèi)生真菌具有良好的開發(fā)潛質(zhì)，并為其次生代謝產(chǎn)物的深層研究提供理論依據(jù)。