黃家望，陳平安，廖 燦，袁 娉，謝 希，孟亞飛，付涵煦，曲 磊，劉 淑?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；4.天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠，天津 300457）

流感嗜血桿菌可分為莢膜型和無莢膜型，后者因不能與已知的莢膜多糖抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，又被稱為不可分型流感嗜血桿菌，它是引起慢性阻塞性肺疾病急性加重的最重要病原菌之一［1］，寄居于上皮細胞和巨噬細胞，借助該生存方式［2］而逃避了局部免疫應(yīng)答，得以在呼吸道中持續(xù)存在，從而與宿主免疫力之間維持一種動態(tài)平衡，當宿主免疫力下降時則大量繁殖，引起感染，嚴重時可危及患者生命，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)疫苗［3-5］。TLR4通路被證實為介導(dǎo)不可分型流感嗜血桿菌誘發(fā)免疫反應(yīng)的重要途徑［6］，與炎癥免疫機制密切相關(guān)［7-8］。

天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠研制的清肺消炎丸由麻黃、地龍、葶藶子、炒苦杏仁、石膏、牛蒡子、人工牛黃、羚羊角八味藥組成，對流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球桿菌等有較顯著的抑制作用，而由不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的肺炎臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、咳嗽、胸悶，與清肺消炎丸主治癥狀相吻合，可為該制劑相關(guān)治療提供理論依據(jù)。因此，本實驗以不可分型流感嗜血桿菌感染的小鼠為研究對象，探討清肺消炎丸是否通過調(diào)控TLR4 介導(dǎo)的信號通路來干預(yù)其誘導(dǎo)的肺部炎癥，為相關(guān)臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 臺式高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；YJ-875A 凈化工作臺（吳江市宇鑫凈化技術(shù)設(shè)備有限公司）；超微量分光光度計（德國Implen公司）；實時定量 PCR 儀、電泳儀、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽、ChemiDoc XRS ＋化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；微量移液器（德國Eppendorf 公司）；A0820 石蠟切片機（美國 AO 公司）；WD-9405B 水平搖床（北京六一儀器廠）；Synergy2 多功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司）。

1.2 試劑 不可分型流感嗜血桿菌購自上海復(fù)祥生物科技有限公司，批號ATCC49247。小鼠IL-1β（批號 ab100704）、IL-6（批號 ab100712）、GCSF（批號 ab197743）、TNF-α（批號 ab100747）ELISIA 檢測試劑盒（英國 Abcam 公司）；Trizol（美國 Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號A3500）、qPCR mix（批號 A6001）（美國 Promega公司）；TLR4、MyD88、TRAF6、β-actin 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；RIPA 蛋白裂解液（批號CW2334S）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號CW0014S）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號CW0022）（北京康為世紀生物科技有限公司）；Fermentas 彩色預(yù)染蛋白Marker（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；ECL 發(fā)光檢測試劑盒（批號35055，美國 Thermo Fisher 公司）；TLR4 抗體（批號 ab13556）、MyD88（批號 ab2064）、TRAF6（批號 ab62488）、β-actin（批號 ab8227）（英國 Abcam公司）；HRP 標記的羊抗鼠二抗（批號 SA00001-1）、羊抗兔二抗（批號 SA00001-2）（美國 Proteintech 公司）。

1.3 動物 6～8 周 C57 小鼠 50 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號 SYXK（湘）2013-0005。

1.4 藥物 清肺消炎丸購自天津中新藥業(yè)集團股份有限公司達仁堂制藥廠（批號9000081），氨芐西林（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號70910804）、麻杏石甘湯（麻黃 9 g、苦杏仁 9 g、石膏18 g、炙甘草6 g）購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。按動物體表面積劑量換算法，雙蒸餾水制備小鼠臨床等效劑量的各藥物水溶液，見表1。

表1 各藥物臨床劑量Tab.1 Clinical dosages of various drugs

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 參考文獻［9］方法制備不可分型流感嗜血桿菌瓊脂珠懸液，10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后作頸部正中切口暴露氣管，將瓊脂珠懸液接種于肺部（2×105CFU），將其注入小鼠氣管后在注入 100 μL 空氣，直立 10 s，使瓊脂珠懸液流入肺部，空白組滴鼻等量生理鹽水。第2天，再將40 只感染小鼠根據(jù)隨機數(shù)字表分為模型組、氨芐西林組、麻杏石甘湯組、清肺消炎丸組，每組 10 只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。見表2。

2.2 指標檢測

2.2.1 一般情況 最后1 次給藥后小鼠禁水禁食8 h，記錄小鼠體質(zhì)量，分離胸腺、脾臟、肺臟并稱定質(zhì)重［9］。

2.2.2 血清炎性細胞因子水平檢測 實驗結(jié)束時處死小鼠，迅速摘除眼球取血，2 500 r／min 離心10 min，分離上層血清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測血清 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α水平。

2.2.3 肺組織病理變化觀察 取小鼠左上葉肺病變區(qū)肺組織，10%中性甲醛固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度 5 μm），HE 染色，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.2.4 肺組織 TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達檢測 采用Westren-blot 法。取小鼠右下葉肺組織，于液氮中研磨至粉末狀，提取組織總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白量，取 50 μg 總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉處理 1 h，加入一抗 TLR4、MyD88、TRAF6 兔抗鼠多克隆抗體（1 ∶1 000），孵育過夜，二抗（1 ∶3 000）室溫下孵育 1 h，暗室加ECL 化學(xué)發(fā)光劑后于化學(xué)發(fā)光儀中成像，IPP6.0 圖像分析軟件進行信號分析，計算目的蛋白／β-actin 蛋白比值。

2.2.5 肺組織 TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達檢測 采用 RT-PCR 法。取右上葉肺組織，Trizol法提取總RNA，超微量紫外分光光度計檢測濃度后將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，熒光定量PCR 試劑盒進行擴增，操作均按相應(yīng)試劑盒說明書進行。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性 10 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，循環(huán)40 次，以 β-actin 為 內(nèi) 參，2-ΔΔCt法 計 算 TLR4、MyD88、TRAF6 相對表達，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊時用 One-Way ANOVA 檢驗，并用LSD 法進行組間多重比較，而方差不齊時用非參數(shù)秩和檢驗，先用Kruskal-Wallis H 檢驗比較總差異，再用Mann-Whitney U 檢驗進行2 組間比較；計數(shù)資料以百分率表示，采用完全隨機設(shè)計多樣本比較的秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 清肺消炎丸對小鼠一般情況的影響 圖1顯示，空白組小鼠精神良好，毛發(fā)有光澤，活動、進食、呼吸正常，體質(zhì)量自然增加；模型組小鼠聳毛、蜷縮、怕冷、毛發(fā)無光澤，呼吸加快、短促，食差、消瘦，與空白組比較，體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著下降（P＜0.01），肺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；給藥組均能不同程度改善小鼠一般情況，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），效果依次為清肺消炎丸組＞氨芐西林組＞麻杏石甘湯組，但組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

3.2 清肺消炎丸對炎性細胞因子水平的影響 圖2顯示，與空白組比較，模型 組 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）；給藥組四者水平不同程度下調(diào)，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），效果依次為氨芐西林組＞清肺消炎丸組＞麻杏石甘湯組，但組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

3.3 清肺消炎丸對小鼠肺組織病理變化的影響 表4、圖3～4顯示，空白組小鼠肺支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺內(nèi)未見炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肺組織間質(zhì)增生明顯，肺泡隔增厚加重，肺泡擴張，肺內(nèi)支氣管上皮細胞脫落、炎性細胞浸潤增多；給藥組均能不同程度改善肺部間質(zhì)增生現(xiàn)象及炎癥滲出，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），但組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 清肺消炎丸對小鼠一般情況的影響Fig.1 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on mice general conditions

圖2 清肺消炎丸對炎性細胞因子水平的影響Fig.2 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on inflammatory cytokine levels

表4 各組小鼠肺組織病變程度（n=10）Tab.4 Lesion degrees of mice lung tissue in various groups（n=10）

3.4 清肺消炎丸對 TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達的影響 圖5顯示，與空白組比較，模型組TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組三者蛋白表達顯著升高（P＜0.01），效果依次為氨芐西林組＞清肺消炎丸組＞麻杏石甘湯組，但組間比較無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠肺組織大體標本Fig.3 Gross specimens of mice lung tissue in various groups

圖4 各組小鼠肺組織病理變化（HE，×200）Fig.4 Pathological changes of mice lung tissue in various groups（HE，×200）

圖5 清肺消炎丸對TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on TLR4，MyD88 and TRAF6 protein expressions

3.5 清肺消炎丸對TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA表達的影響 圖6顯示，與空白組比較，模型組TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組三者mRNA 表達顯著升高（P＜0.01），效果依次為氨芐西林組＞清肺消炎丸組＞麻杏石甘湯組。

圖6 清肺消炎丸對TLR4、 MyD88、 TRAF6 mRNA 表達的影響Fig.6 Effects of Qingfei Xiaoyan Pills on TLR4， MyD88 and TRAF6 mRNA expressions

4 討論

不可分型流感嗜血桿菌侵入下呼吸道后的感染會釋放細菌內(nèi)毒素、纖毛毒素、蛋白水解酶等細菌產(chǎn)物，導(dǎo)致前炎癥細胞因子釋放，中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞在氣道和肺實質(zhì)的聚集和脫顆粒，誘導(dǎo)呼吸道黏膜上皮細胞釋放前炎癥細胞因子IL-8、IL-6、TNF-α、ICAM-1 表達，從而 引發(fā) 炎癥，導(dǎo)致肺實質(zhì)損傷和進行性小氣道閉塞，甚至組織破壞和重構(gòu)［10］。炎癥反應(yīng)的啟動有賴于模式識別受體（PRRS）對病原體保守分子的識別［11］，可識別流感嗜血桿菌的 PRRS 主要為 Toll 樣受體（TLR）［12-13］，其中 TLR4 是典型的模式識別受體，主要表達于單核-巨噬細胞表面，識別內(nèi)外源性致炎因子，介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)［14-15］。Wang 等［16］發(fā)現(xiàn)，LPS 可誘導(dǎo)活化巨噬細胞，激活 TLR4-MYD88-TRAF6 信號通路，誘導(dǎo)肺實質(zhì)損傷，抑制該信號通路時可抑制LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺實質(zhì)損傷；Xu 等［17］報道，透明質(zhì)酸可通過影響 TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路來減輕LPS 誘發(fā)急性肺損傷小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)和病理損害；本實驗證實TLR4在不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥的發(fā)病機制中有著重要作用，其機制可能是TLR4 通過直接或間接識別不可分型流感嗜血桿菌，啟動MyD88 依賴的信號通路，激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白 6（TKAF6），進而引起 TNF-a、IL-Iβ、IL-6 等促炎因子介導(dǎo)機體抗細菌免疫應(yīng)答，引起一系列炎癥反應(yīng)，這也提示藥物若能在早期干預(yù)，可通過有效阻止不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的TLR4-MyD88-TRAF6 信號通路激活來避免或減輕肺部損傷。

清肺消炎丸以 《傷寒論》 中麻杏石甘湯為基礎(chǔ)，保留主要藥材麻黃、石膏、苦杏仁，增加地龍、牛蒡子、葶藶子、人工牛黃、羚羊角，方中麻黃辛溫，宣肺平喘，是為君藥；石膏辛甘大寒，清瀉肺火；地龍清熱平喘，共為臣藥；苦杏仁甘大寒，止咳平喘；葶藶子瀉肺平喘；牛蒡子解毒利咽；牛黃、羚羊角清熱豁痰、涼肝熄風(fēng)，共為佐藥。該制劑既能宣通，又清內(nèi)熱，還有化痰、止咳、平喘的功效［18］，現(xiàn)代研究表明［19］它具有止咳平喘、清肺化痰的功效，還可降低炎癥因子表達，減少肺部細胞因子、炎細胞浸潤，改善肺部組織壞死脫落，具有較好的抗炎效果。

本實驗發(fā)現(xiàn)，清肺消炎丸能顯著下調(diào)血清炎性細胞因子 IL-1β、IL-6、GCSF、TNF-α 水平及肺組織 TLR4、MYD88、TRAF6 蛋白、mRNA 表達，其機制可能是通過調(diào)控不可分型流感嗜血桿菌感染激活的TLR4-MYD88-TRAF6 信號通路，進而抑制炎性細胞因子分泌，最終改善小鼠肺組織損傷和炎癥程度。但TLR4-MYD88-TRAF6 信號通路是否為不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)肺部炎癥的唯一通路還需進一步研究，而清肺消炎丸藥效成分復(fù)雜，作用靶點多樣，其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)也需深入探索。