梁 穎，許文佳，符策奕，陳國(guó)彪

（海南省藥品檢驗(yàn)所，海南 ?？?570216）

楓蓼腸胃康是以辣蓼和牛耳楓為原料制成的純中藥制劑，具有理氣健胃、除濕化滯等功效［1］，臨床上對(duì)急慢性腸胃炎、腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等胃腸道疾病具有顯著療效［2-5］，并且無(wú)明顯不良反應(yīng)。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的楓蓼腸胃康標(biāo)準(zhǔn)中，以蘆丁為含有量指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，但中藥復(fù)方制劑具有多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，單一成分難以全面反映其質(zhì)量和療效［6］。近年來(lái)報(bào)道楓蓼腸胃康中的有效成分主要為黃酮［7-10］，并用液相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量分析［11-13］；另有學(xué)者確定其中含有酚酸類(lèi)成分，并測(cè)定其含有量［14-15］，但迄今尚無(wú)同時(shí)對(duì)黃酮、酚酸等多種成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的報(bào)道。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS／MS）具有較高的專屬性和靈敏度，可在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)對(duì)酚酸、黃酮類(lèi)成分進(jìn)行有效分離，并完成準(zhǔn)確定性定量分析［16］，大大提高了檢測(cè)效率。因此，本實(shí)驗(yàn)建立該方法同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康合劑、膠囊中10種成分（沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素）的含有量，以期全面評(píng)價(jià)該復(fù)方質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 U3000 液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司）；API4000＋質(zhì)譜儀，配置AB SCIEX質(zhì)譜工作站（美國(guó)AB公司）；Mili-Q 超純水器（美國(guó)Millipore公司）；XS205DU 電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；SK8210HC 超聲波提取儀（上海科頡貿(mào)易有限公司）。

1.2 試藥 楓蓼腸胃康合劑（海南萬(wàn)州制藥有限公司，批號(hào) 151001、151102、151103、151201、160101、160102）；楓蓼腸胃康膠囊（?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰?，批號(hào) S141201、S141202、S141203）。沒(méi)食子酸（批號(hào) 110831-201605，含有量 90.8%）、原兒茶酸（批號(hào) 110809-200503）、蘆?。ㄅ?hào) 100080-201610，含有量 91.9%）、金絲桃苷（批號(hào) 111521-201708，含有量 95.1%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)111207-201602，含有量90.8%）、槲皮苷（批號(hào) 111538-200302）、槲皮素（批號(hào) 100081-201509，含有量 98.1%）、山柰酚（批號(hào) 110860-201310，含有量 93.2%）、芹菜素（批號(hào)111901-201102，含有量 99.6%）、異鼠李素（批號(hào) 110860-201410，含有量 99.9%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、乙酸為色譜純；水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。有機(jī)濾膜（尼龍，0.22 μm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品適量，甲醇分別制成 1.107、1.087、1.130、0.976、1.265、1.072、1.146、0.456、0.813、0.092 7 mg／mL 貯備液，分別精密吸取 2、10、10、1、10、5、1、2、1、10 mL，置于同一 100 mL 量瓶中，甲醇分別稀釋成 0.022 1、0.108 7、0.113 0、0.009 76、0.126 5、0.053 6、0.011 5、0.009 12、0.008 13、0.009 27 mg／mL，即 得，于 4 ℃ 下保存。

2.2 供試品溶液制備 精密量取2 mL 合劑于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取1 mL 于 10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得（用于測(cè)定蘆丁、沒(méi)食子酸）。再取膠囊內(nèi)容物適量，混勻，精密稱取 0.4 g，置于 50 mL 量瓶中，加 40 mL 甲醇超聲 20 min，放冷，甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取 2 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（用于測(cè)定蘆丁、沒(méi)食子酸）。上機(jī)測(cè)定前，溶液均用 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 色譜條件 Luna C8色譜柱（2 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）（含 0.1% 乙酸），梯度洗脫（0～2 min，5%A；2～4 min，5%～20%A；4～6 min，20%A；6～12 min，20%～30%A；12～17 min，30%A；17～23 min，30%～5%A；23～30 min，5% A）；柱溫 35 ℃；體積流量0.3 mL／min；進(jìn)樣量 1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子噴霧負(fù)電壓 4.5 kV；離子源溫度450 ℃；簾氣 15 kPa；碰撞氣氮?dú)?；霧化氣45 kPa；輔助氣 45 kPa，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

2.5 方法學(xué)考察

圖1 各成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

2.5.1 線性關(guān)系考察 取 “2.1”項(xiàng)下貯備液適量，50%甲醇制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，以 S／N=10 為定量限，S／N=3 為檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取 “2.5.1”項(xiàng)下中間質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在 “2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定 6 次，測(cè)得沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素峰面積 RSD分別為6.55%、6.30%、6.29%、5.59%、6.89%、5.67% 、6.24% 、6.75% 、6.75% 、4.23% ，表 明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取合劑（批號(hào)151201）、膠囊（批號(hào) S141201）適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各 6 份，在 “2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得合劑供試品溶液中沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素含有 量 RSD 分 別 為 4.90%、2.95%、6.47%、5.23% 、7.55% 、7.47% 、5.19% 、3.31% 、5.60% 、5.28%，膠囊供試品溶液中分別為4.93%、7.87%、6.40% 、7.10% 、8.91% 、3.44% 、6.54% 、6.88% 、7.91%、7.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取合劑（批號(hào)151201）、膠囊（批號(hào) S141201）適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于 0、2、4、8、12、24 h在 “2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得合劑供試品溶液中沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素含有量 RSD 分別為5.15% 、5.62% 、6.37% 、5.50% 、6.68% 、4.88% 、2.21% 、5.34% 、7.27% 、6.88% ，膠 囊供試品溶液中分別為 3.98%、6.30%、5.37%、6.28% 、7.73% 、4.27% 、8.54% 、6.46% 、7.47%、7.22%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取合劑（批號(hào)151201）1 mL，置于 50 mL 量瓶中，精密加入“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量（使對(duì)照品加入后成分含有量與測(cè)定成分原含有量的比例約為80%、100% 、120% ），平行 3 份，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 A，在 “2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算 8種成分（蘆丁、沒(méi)食子酸除外）回收率；同法制備供試品溶液B，計(jì)算蘆丁、沒(méi)食子酸回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素平均加樣回收率分別為101.7%、104.0%、101.3%、100.4%、95.4%、99.5% 、102.0%、100.4% 、102.0% 、101.4%，RSD分別為3.5%、6.4%、8.7%、8.0%、8.0%、4.3%、5.2%、7.5% 、6.2% 、5.7%。

精密稱取膠囊（批號(hào)S141201）內(nèi)容物0.2 g，置于50 mL 量瓶中，精密加入 “2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量（使對(duì)照品加入后成分含有量與測(cè)定成分原含有量比例約為 80%、100%、120%），平行3 份，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 A，在“2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算 8種成分（蘆丁、沒(méi)食子酸除外）回收率；同法制備供試品溶液B，計(jì)算蘆丁、沒(méi)食子酸回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素平均加樣回收率分別為 101.6%、103.6% 、99.3% 、96.8% 、99.9% 、101.7% 、100.7%、102.6%、98.2%、98.7%，RSD 分別為3.6% 、7.0% 、7.6% 、8.9% 、4.4% 、5.5% 、6.1% 、4.6% 、6.2% 、7.1% 。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.6 樣品含有量測(cè)定 取合劑6 批（批號(hào)151001、151102、151103、151201、160101、160102）、膠囊 3批（S141201、S141202、S141203），按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3”～“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n=3）

3 討論

3.1 色譜柱選擇 文獻(xiàn)中通常采用C18色譜柱分離成分，但預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該色譜柱下槲皮素、山柰酚色譜峰拖尾嚴(yán)重，山柰酚、芹菜素、異鼠李素色譜峰分離度不理想，而采用C8色譜柱時(shí)各色譜峰分離度比較理想，峰形尖銳對(duì)稱，故選擇其作為分離柱。

3.2 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化 由于10種成分中有一些性質(zhì)接近，故選擇梯度洗脫方式，可使所有成分得到完全分離。本實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇-水、乙腈-水、甲酸-水、乙酸-水、乙酸銨-水的分離效果，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)色譜峰噪音較大，響應(yīng)值偏低，故選擇乙腈-水，為了改善待測(cè)成分色譜峰峰形，又在流動(dòng)相中加入一定量酸，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水（含 0.1% 乙酸），此時(shí)峰形良好，在17 min內(nèi)可洗脫出所有成分，從而提高了分離效率。在研究離子掃描模式時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃酮、酚酸類(lèi)成分在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值較高，基于山柰酚靈敏度相對(duì)偏低，故提高其駐留時(shí)間為100 ms。

3.3 含有量分析 在6 批楓蓼腸胃康合劑、3 批楓蓼腸胃康膠囊中，蘆丁含有量最高，并且不同批次樣品中各成分含有量存在一定差異，這可能與工藝生產(chǎn)過(guò)程中投料藥材來(lái)源、產(chǎn)地、采收期等，以及不同廠家煎煮、濃縮等環(huán)節(jié)中溫度、濕度控制存在差異有關(guān)［17-18］。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定楓蓼腸胃康合劑、膠囊中沒(méi)食子酸、原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、異鼠李素的含有量，該方法高效快速，準(zhǔn)確可靠，可為該制劑質(zhì)量控制提供新的參考方法。