高天慧，陳雯清，陳詩韻，廖 婉，傅超美

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137）

蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisVal.為川產(chǎn)道地藥材，是2015年版 《中國藥典》 收載的莪術(shù)主要來源之一，具有行氣破血、消積止痛功效，常用于治療飲食積滯、痞滿呃逆等癥［1］，經(jīng)醋制后行氣破血之力更勝，而且峻猛藥性減緩［2-7］，揮發(fā)油、總姜黃素為其主要有效成分，其中前者以吉馬酮、莪術(shù)烯、莪術(shù)酮、莪術(shù)醇、β-欖香烯等為代表［8-9］，而后者以雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素等為代表［10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，蓬莪術(shù)對刀豆蛋白A 所致免疫性肝損傷具有良好的保護作用，并且經(jīng)醋制后利肝抗炎活性增強［11］；姜黃素和雙去甲氧基姜黃素是該藥材主要藥效成分［12］，而且前者含有酚羥基和烯醇式羥基，可阻斷氧化反應(yīng)中自由基鏈式反應(yīng)，從而發(fā)揮抗氧化自由基作用［13］。本實驗通過正交試驗結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化醋制蓬莪術(shù)中總姜黃素回流提取工藝，以期為后續(xù)該藥材炮制機理研究及相關(guān)制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，型號CPA225D］；純水機（優(yōu)普純水系統(tǒng)上海分公司，型號 UPK-I-10T）；高效液相色譜儀（日本島津公司，型號LC-2030C3D）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海泉杰儀器有限公司，型號 OSB-2100）。雙去甲氧基姜黃素（CAS號 33171-05-0，批號140613）、去甲氧基姜黃素（CAS號 24939-17-1，批號 140815）、姜黃素（CAS號 458-37-7，批號140612）對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司，含有量均≥98%。蓬莪術(shù)采自道地產(chǎn)區(qū)四川省，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標本中心蔣桂華教授鑒定為蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisVal.。乙腈為色譜純（美國Sigma-Aldrich 公司）；冰醋酸（成都市聯(lián)合化工試劑研究所，批號 201411041）；9°米醋（佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，批號20150210）。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋制蓬莪術(shù)制備 采用前期專利（公開號CN103463567A）報道的方法［14］，取適量生品，加入9°米醋（用量30%）拌勻悶潤2 h，煮至醋液收干，120 ℃ 下干燥 30 min，取出，稍冷后干燥，即得［15］。

2.2 總姜黃素制備 取去油醋制品藥渣100 g，按不同體積分數(shù)乙醇、提取時間、提取次數(shù)進行試驗，濾棄藥渣，合并濾液，濃縮成稠浸膏，即得。

2.3 總姜黃素含有量測定

2.3.1 色譜條件［1］Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-4% 冰醋酸（48 ∶52）；體積流量 1 mL／min；檢測波長430 nm；柱溫 25 ℃；進樣量 10 μL，色譜圖見圖1，可知上述條件下各成分色譜峰分離度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對照品適量，置于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 8 mL，40 kHz 下超聲溶解混勻，定容，作為貯備液，各取2 mL 于10 mL 棕色量瓶中，定容，混勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備［16-17］取 “2.2”項下 9份稠浸膏，每份 1 g，置于 100 mL 錐形瓶中，精密加入 50 mL 甲醇，搖勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲1 h，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取 “2.3.2”項下貯備液，倍比稀釋成系列質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度試驗 取 “2.3.2”項下對照品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定 6 次，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為0.09%、0.12%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批稠浸膏，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為1.85%、0.81%、0.46%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一批稠浸膏，同法提取后在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD 分別為1.04%、0.17%、0.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量已知的稠浸膏 6 份，加入對照品溶液，按 “2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.4 正交試驗 選擇乙醇體積分數(shù)（A）、乙醇用量（B）、提取次數(shù)（C）、提取時間（D）作為影響因素，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量作為評價指標，設(shè)計 L9（34）表，因素水平見表3，結(jié)果見表4，方差分析見表5。由此可知，各因素影響程度依次為A＞C＞B＞D，因素 A對各成分含有量有顯著影響（P＜0.05），最優(yōu)工藝是 A3B1C1D1，即加入 3 倍量 95% 乙醇提取 1 次，每次1 h。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

2.5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法 以 “2.4”項下數(shù)據(jù)為訓(xùn)練樣本，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間為輸入節(jié)點，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量為輸出節(jié)點，建立并訓(xùn)練該網(wǎng)絡(luò)模型。再以縱坐標為網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)預(yù)測，橫坐標為正交試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)基本都集中分布在實線與虛線重疊的直線上，理想回歸直線與最優(yōu)回歸直線幾乎全部重合（相關(guān)系數(shù)分別為 1、0.999 9、1），而且網(wǎng)絡(luò)期望輸出和實際輸出的相對誤差均小于1%，表明其性能和預(yù)測能力良好，最優(yōu)工藝加入3 倍量95%乙醇提取 2 次，每次 2 h。

2.6 驗證試驗 稱取6 份去油醋制品藥渣，每份100 g，分別按正交試驗、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化工藝平行3 次驗證試驗，測得雙去甲氧基姜黃素含有量分別為 1.00 μg／mL（RSD=0.42% ）、1.12 μg／mL（RSD=0.14%），去甲氧基姜黃素含有量分別為17.52 μg／mL（RSD=0.43%）、19.83 μg／mL（RSD=1.06%），姜黃素含有量分別為 28.29 μg／mL（RSD=0.43%）、30.00 μg／mL（RSD= 1.04%）。由此可知，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化后各成分含有量較高，重復(fù)性較好。

3 討論與結(jié)論

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是模擬生物學(xué)中大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的一種算法模型，廣泛用于信息處理與分析，由接受信息的輸入層、輸出信息的輸出層以及中間隱含層構(gòu)成，見圖2。該方法在處理非線性問題上獨具優(yōu)勢，能很好地反映對象輸入、輸出之間復(fù)雜的非線性關(guān)系［18］，很多學(xué)者將傳統(tǒng)方法（如正交試驗）與其相結(jié)合來模擬試驗過程，可減少大量反復(fù)的驗證性工作，更方便快捷地獲得多因素連續(xù)區(qū)域中的最優(yōu)組合［15，19-20］。

圖2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)Fig.2 Model structure of artificial neural network

本實驗結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與正交試驗，得到醋制蓬莪術(shù)中總姜黃素最優(yōu)回流提取工藝為加入3 倍量95%乙醇提取2 次，每次2 h，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化后雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含有量分別為 1.12、19.83、30.00 μg／mL，均高于正交試驗優(yōu)化后，而且該方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。但目前對醋制蓬莪術(shù)中提取得到的總姜黃素缺乏一套完整的質(zhì)量標準控制體系，仍未將體外提取工藝和體內(nèi)藥效學(xué)表征有機結(jié)合起來，醋制后破血消癥功效增強的物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)具體的作用機制尚不清楚，亟待更深入考察。