關(guān)利平，張偉，王紫寒，邵小杰

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界性的重要果樹，也是我國的大宗果品。據(jù)農(nóng)業(yè)部年鑒統(tǒng)計(jì)，2017年我國葡萄栽培面積87萬 hm2，居世界第2位；葡萄總產(chǎn)量1308萬 t，居世界第一位，已成為名副其實(shí)的葡萄生產(chǎn)大國[1]。

銅是植物生長必需的微量元素[2-3]，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用。銅是Cu/Zn-SOD酶、多酚氧化酶的組成部分，參與呼吸代謝、光合作用等生理過程。一定量的銅促進(jìn)植物生長發(fā)育[4]，但是當(dāng)銅含量過高，則會(huì)對(duì)植物發(fā)生毒害作用[5]。同時(shí)也可通過食物進(jìn)入人體，危害人類的身體健康。

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，土壤已出現(xiàn)不同程度的重金屬污染[6]，我國土壤銅含量為3～300 mg/kg。由于含銅殺菌劑（波爾多液等）的頻繁使用，果園土壤中銅污染嚴(yán)重[7-8]。葡萄是使用銅農(nóng)藥較多的果樹，常常發(fā)生銅毒害[9]。通過對(duì)山東省部分長期施用波爾多液的葡萄園土壤調(diào)查顯示，其含銅量為252.52～487.62 mg/kg[10]。目前，人們尚未揭示葡萄高抗銅脅迫的機(jī)理，因此開展葡萄對(duì)銅的響應(yīng)基礎(chǔ)研究，為認(rèn)識(shí)葡萄抗銅的分子機(jī)制提供重要的理論依據(jù)?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，本文以葡萄扦插苗為材料，研究不同濃度Cu2+對(duì)葡萄根系抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為葡萄抗銅的分子機(jī)理和銅制劑在葡萄上的合理利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

為當(dāng)年生‘玫瑰香’‘澤香’葡萄扦插苗，枝條長勢正常，管理水平良好。首先于2012年12月份剪取兩品種一年生長勢好的成熟枝條，埋土越冬；然后于來年3月份取出進(jìn)行沙池扦插（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站和果樹栽培生理實(shí)驗(yàn)室）。待扦插苗長至6～10個(gè)主根系，選取長勢一致、有足量白根的葡萄扦插苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)方法

首先將材料進(jìn)行饑餓處理（去離子水中過渡培養(yǎng)10 h），然后進(jìn)行不同濃度銅處理：1/2 Hoagland營養(yǎng)液為對(duì)照（CK），設(shè)4個(gè)銅離子濃度，A：1/2 Hoagland+0.5 mmol/L CuSO4·5H2O；B：1/2 Hoagland+1.0 mmol/L CuSO4·5H2O；C：1/2 Hoagland+1.5 mmol/L CuSO4·5H2O；D：1/2 Hoagland+2.0 mmol/L CuSO4·5H2O。

每個(gè)處理4株，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理24 h后，選取長勢一致的扦插苗的根系（從根部剪?。瑯悠贩湃胍旱賰?，于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定項(xiàng)目

超氧化物歧化酶（S O D）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法測定[13]，過氧化物酶（POD）活性用愈創(chuàng)木酚比色法測定[14]，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用紫外吸收法[15]。

根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定，用四氮唑的還原強(qiáng)度（μg/g·h）表示根系活力[16]；相對(duì)電導(dǎo)率的測定采用浸泡法[17]；丙二醛（MDA）含量采用王愛國等[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Office 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，并用DPS 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's新復(fù)方極差法進(jìn)行不同處理間差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅處理對(duì)葡萄根系活性的影響

根系是直接受重金屬毒害的器官。根系活力直接反應(yīng)根系的代謝強(qiáng)度。從表1看出，Cu2+對(duì)葡萄根系活力有抑制作用，二者呈顯著負(fù)相關(guān)。隨著Cu2+濃度的增加，根系活力下降趨勢增加。Cu2+濃度為0.5 mmol/L時(shí)，根系活力下降了25.73%，而濃度為1.5 mmol/L時(shí)，根系活力下降了40.93%，十分明顯。而1.5 mmol/L和2 mmol/L的Cu2+濃度處理對(duì)根系活力的影響差異不顯著，說明隨著處理濃度的繼續(xù)升高，根系活力響應(yīng)不敏感。

表1 不同濃度銅處理對(duì)葡萄根系活性的影響Table 1 Effects of copper on grape roots activity

植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用。逆境脅迫強(qiáng)度與膜透性增大的程度有關(guān)。如表1所示，本試驗(yàn)設(shè)置的Cu2+濃度下，膜功能受損或結(jié)構(gòu)破壞而通透性增大，電解質(zhì)外滲加劇，電導(dǎo)率的增加也越大。Cu2+濃度為2 mmol/L時(shí)，兩品種的根系相對(duì)電導(dǎo)率最大，高達(dá)對(duì)照的3倍，此時(shí)根系細(xì)胞質(zhì)膜受損傷的程度已經(jīng)很大。

根系活力下降，細(xì)胞膜遭受損傷嚴(yán)重，根系的電導(dǎo)率升高，膜脂過氧化加重，從而使MDA含量增加。表1顯示，增加Cu2+濃度將明顯提高葡萄根系中MDA的含量。特別是在Cu2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)，MDA含量顯著高于低濃度Cu2+處理，分別為對(duì)照的1.6倍、1.8倍。

2.2 銅處理對(duì)葡萄根系抗氧化物酶活性的影響

SOD、POD、CAT是植物體活性氧清除系統(tǒng)，廣泛分布于植物各組織器官，能有效清除自由基和過氧化物，以避免自由基積累對(duì)生物膜造成破壞。如表2所示，在1.5 mmol/L Cu2+濃度下，葡萄根系SOD酶活性達(dá)到最大，與對(duì)照差異顯著，比對(duì)照增加近1倍。在2 mmol/L Cu2+濃度下，SOD活性下降，與對(duì)照無顯著差異。在1.0 mmol/L Cu2+濃度下POD酶活性達(dá)最大，兩品種分別為對(duì)照的5.9倍和4.7倍，與對(duì)照差異顯著；在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+濃度下，POD活性下降，仍與對(duì)照差異顯著。在0～2 mmol/L銅濃度下CAT活性也呈先升高后降低的趨勢。在1.0 mmol/L的Cu2+濃度下，CAT活性達(dá)最大，與對(duì)照差異顯著，分別為對(duì)照的3.2倍、4.2倍。在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+濃度下，‘玫瑰香’葡萄根系CAT活性仍顯著高于對(duì)照，而‘澤香’葡萄根系CAT活性與對(duì)照無顯著差異。在1.0～1.5 mmol/L的Cu2+濃度處理下，SOD、POD、CAT活性變化明顯。

表2 不同濃度銅處理對(duì)葡萄根系抗氧化物酶活性的影響Table 2 Effects of copper on SOD, POD, CAT characteristics in grape roots

表3 不同濃度銅處理對(duì)葡萄根系活性氧的影響Table 3 Effects of copper on O·, H2O2 contents in grape roots

表3 不同濃度銅處理對(duì)葡萄根系活性氧的影響Table 3 Effects of copper on O·, H2O2 contents in grape roots

處理Treatment(μmol/g FW)玫瑰香 Muscat Hamburg 澤香 Zexiang O2-·/(μmol/min·g FW)H2O2/O2H2O2/(μmol/g FW)-·/(μmol/min·g FW)CK 527.41 d 38.03 d 509.25 c 27.99 d A 693.28 c 43.47 c 585.71 c 38.87 c B 1303.69 a 59.33 a 1399.02 a 51.04 a C 1078.55 b 48.69 b 932.44 b 49.23 ab D 629.17 c 46.23 c 597.47 c 47.19 b

2.3 銅脅迫對(duì)葡萄根系活性氧（ROS）的影響

活性氧是植物體在脅迫條件下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。如表3所示，根系在Cu2+脅迫下產(chǎn)生和H2O2，對(duì)根系造成傷害。在設(shè)置的4個(gè)Cu2+濃度處理下，葡萄根系和H2O2含量呈“先升后降”的趨勢。在1.0 mmol/L的Cu2+濃度下，和H2O2含量最高，與對(duì)照有顯著差異，分別為對(duì)照的2.5倍、1.6倍。在1.5 mmol/L、2 mmol/L的Cu2+濃度下，根系產(chǎn)生的·和H2O2呈下降趨勢，但仍高于對(duì)照。

3 討論

正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但是當(dāng)植物遭受外界脅迫時(shí)，活性氧平衡被打破，會(huì)產(chǎn)生活性氧的積累和爆發(fā)[19]。本研究顯示，在較低銅濃度（0.5～1 mmol/L）脅迫時(shí)，葡萄根系產(chǎn)生速率、H2O2含量顯著升高，對(duì)應(yīng)濃度下的POD、SOD和CAT活性也隨銅濃度的增大而大幅度升高，表明銅處理啟動(dòng)了葡萄根系中的抗氧化酶系統(tǒng)。SOD作為植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵酶，首先將歧化成H2O2和O2，而CAT和POD則進(jìn)一步將H2O2直接分解為H2O和O2，三者共同組成一個(gè)有效的活性氧清除系統(tǒng)，從而減少H2O2和O2的積累[20-21]。但較高銅濃度（1.5～2 mmol/L）脅迫下，抗氧化物酶活性急劇下降，表明抗氧化酶的保護(hù)作用是有限的，超過一定的閾值，抗氧化酶本身也會(huì)受到傷害。我們還注意到，‘玫瑰香’‘澤香’葡萄對(duì)銅脅迫的反應(yīng)呈現(xiàn)了基本一致的規(guī)律，但3種抗氧化酶對(duì)銅脅迫敏感性是有差異的，其中SOD最不敏感，CAT最為敏感，在較高銅濃度（1.5～2 mmol/L）下，CAT活性低于或與對(duì)照持平，表明已基本失去保護(hù)作用。

MDA含量變化反映膜脂過氧化程度，細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞[21]，銅脅迫處理24 h后，兩品種根系MDA含量均顯著升高，同時(shí)伴隨著相對(duì)電導(dǎo)率的升高，表明兩個(gè)品種根系細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性均受到傷害，增加了膜透性，造成電解質(zhì)外滲。而較高銅濃度（1.5～2 mmol/L）脅迫導(dǎo)致抗氧化物酶活性急劇下降，保護(hù)作用降低，膜脂過氧化程度和膜的透性進(jìn)一步提高，大量外滲的電解質(zhì)通過滲透脅迫加劇傷害，兩者的升高與根系活力的急劇下降顯示了一致的結(jié)果，表明銅脅迫隨濃度提高確實(shí)加劇了葡萄根系的傷害。

值得注意的是，盡管‘玫瑰香’‘澤香’對(duì)銅脅迫的生理反應(yīng)呈現(xiàn)了基本一致的規(guī)律，但兩個(gè)品種3種抗氧化酶的活性、MDA含量對(duì)銅脅迫的敏感性是有差異的，在0～2 mmol/L范圍內(nèi)，‘澤香’的抗氧化酶的活性升高幅度和下降幅度更大，MDA含量升高幅度更大，表明‘澤香’抗氧化酶的活性和MDA含量對(duì)銅脅迫的響應(yīng)比‘玫瑰香’更敏感，其耐銅性的強(qiáng)弱還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)用Cu2+對(duì)當(dāng)年生的葡萄扦插苗進(jìn)行處理，并分析了不同濃度的Cu2+處理對(duì)葡萄根系活性、抗氧化物酶活性和活性氧含量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：本試驗(yàn)設(shè)置的Cu2+濃度下均使根系活力下降，細(xì)胞膜遭受損傷嚴(yán)重，根系的電導(dǎo)率升高，膜脂過氧化加重，從而使丙二醛含量增加；在1.0 mmol/L的和1.5 mmol/L Cu2+濃度處理下，SOD、POD、CAT酶活性達(dá)到最高；在1.0 mmol/L的Cu2+濃度處理下，和H2O2含量最高。