動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是世界公認(rèn)的威脅人類健康的首要致殘、致死原因[1]，由此導(dǎo)致的心腦血管意外嚴(yán)重威脅人類生命。近年來(lái)的研究逐漸表明動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展受一系列炎性因子介導(dǎo)與調(diào)控。在抗AS方面，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)作為重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)等抗AS環(huán)節(jié)[2-3]。穩(wěn)消Ⅱ方是我院霍清萍教授多年來(lái)控制AS、穩(wěn)定斑塊的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效較為滿意。本研究通過(guò)建立高脂飼料實(shí)驗(yàn)兔AS模型，觀察穩(wěn)消Ⅱ方對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究穩(wěn)消Ⅱ方抗AS的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭健康大白兔38只，月齡3～4個(gè)月，體重1.9～2.3 kg，購(gòu)自上海車墩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物良種廠[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0008]，雌雄不限。飼養(yǎng)條件為2級(jí)，相對(duì)濕度50%，飼養(yǎng)室溫控制在20～24 ℃，光照時(shí)段06：00～18：00。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 高脂飼料(由91%普通食料、1%膽固醇、5%蛋黃粉、3%豬油組成)委托上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代為加工。穩(wěn)消Ⅱ方免煎顆粒(水蛭、地龍、丹皮、丹參、郁金、半夏)及辛伐他汀給藥劑量及方法按照課題組前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]，并結(jié)合人與動(dòng)物體質(zhì)量比例折算[5]后給藥。

1.3 主要試劑與儀器 包括PPARγ抗體、PPARγ免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒；離心機(jī)、脫色搖床、移液槍、正置熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)等。

1.4 造模與分組 實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件同1.1。稱重，用完全隨機(jī)分組法[6]分為空白組(9只)與造模組(29只)。造模組干預(yù)8周后取2只兔腹主-髂總動(dòng)脈分支處向上1.5～2.0 cm為標(biāo)本，肉眼觀察動(dòng)脈斑塊的顏色、形態(tài)、大小，經(jīng)HE染色后確認(rèn)造模成功。然后將造模組實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為模型組(9只)、對(duì)照組(9只)及穩(wěn)消Ⅱ方組(9只)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中喂養(yǎng)方式、各組藥物劑量及給藥方法、干預(yù)時(shí)間均參照課題組前期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行[4]。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血脂檢測(cè) 分別于造模前、造模后、干預(yù)后經(jīng)兔耳緣靜脈采血，離心后測(cè)定血脂[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)]指標(biāo)。

1.5.2 PPARγ檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，全部實(shí)驗(yàn)兔予3%戊巴比妥鈉肌肉注射麻醉，無(wú)菌條件下取腹主-髂總動(dòng)脈分支處向上1.5～2.0 cm，用0.9%NaCl洗滌后置于4%多聚甲醛固定，免疫組化法測(cè)定PPARγ蛋白表達(dá)。各組每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野在200倍光鏡下拍照。應(yīng)用Image-Pro 6.0選取各視野相同棕黃色作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定每張200倍照片的PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞的比率及灰度，得出陽(yáng)性的累積光密度值(IOD)，并計(jì)算圖片組織的累積光密度值/面積(AREA)，得出IOD/AREA比值。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)共計(jì)33只實(shí)驗(yàn)兔(空白組8只、模型組8只、對(duì)照組8只、穩(wěn)消Ⅱ方組9只)，造模期間死于肺炎、腹瀉各1只，死因不明1只，隨機(jī)處死2只。各實(shí)驗(yàn)兔于藥物干預(yù)期間生命體征平穩(wěn)。

2.2 各組血脂檢測(cè)結(jié)果 造模前空白組與造模組血脂水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，造模組TC、TG、LDL較空白組顯著升高(P<0.05)，HDL較空白組顯著下降(P<0.05)；對(duì)照組、穩(wěn)消Ⅱ方組、模型組干預(yù)前血脂水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后，穩(wěn)消Ⅱ方組、對(duì)照組TC、TG、LDL較模型組顯著下降(P<0.05)，HDL水平較模型組顯著升高(P<0.05)。穩(wěn)消Ⅱ方組與對(duì)照組血脂水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，穩(wěn)消Ⅱ方組與對(duì)照組干預(yù)后血脂水平與干預(yù)前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表1、表2。

表1 空白組與造模組造模前后血脂比較(±s) mmol/L

與空白組造模后比較，1)P<0.05

表2 各組干預(yù)前后血脂比較(±s) mmol/L

與同組干預(yù)前比較，1)P<0.01；與模型組干預(yù)后比較，2)P<0.05

2.3 PPARγ免疫組化結(jié)果 對(duì)PPARγ陽(yáng)性結(jié)果(IOD/AREA)分析如下：與空白組相比，模型組動(dòng)脈內(nèi)膜下棕黃色顆粒狀陽(yáng)性染色物質(zhì)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，穩(wěn)消Ⅱ方組與對(duì)照組內(nèi)膜下陽(yáng)性染色物質(zhì)均有顯著增加(P<0.05)；穩(wěn)消Ⅱ方組PPARγ表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組PPARγ蛋白表達(dá)水平(±s)

與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05

圖1PPARγ免疫組化結(jié)果(×200)

3 討 論

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，PPARγ信號(hào)通路在改善脂質(zhì)代謝紊亂、穩(wěn)定粥樣斑塊過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是抗AS的重要研究靶點(diǎn)。PPARγ不僅可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及泡沫細(xì)胞的生成起到抗炎作用，還可減少單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為粥樣斑塊[7]，有助于穩(wěn)定斑塊。被配體激活的PPARγ可減少多種炎癥因子包括血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子(intercellularadhesion molecular-1，ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)和E-選擇素的蛋白表達(dá)，抑制動(dòng)脈血管中層平滑肌細(xì)胞增生遷移至內(nèi)膜[8-10]。PPARγ通過(guò)調(diào)節(jié)下游多個(gè)靶點(diǎn)拮抗氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)攝入，促使細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，減少脂質(zhì)聚積[11]，從而增加斑塊的穩(wěn)定性、延緩AS進(jìn)展。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為AS的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素，如年老體衰、六淫侵襲、情志失調(diào)、飲食勞倦，或由其他病因?qū)е碌呐K腑氣血功能失調(diào)等。濕、熱、痰、瘀、虛及毒邪等多種致病因素相互夾雜、相互轉(zhuǎn)化，損傷脈道，病性多本虛標(biāo)實(shí)。在臨床診療過(guò)程中本病病人多有口干口苦、大便粘滯、舌紅苔黃膩、脈弦數(shù)等痰濕瘀阻、蘊(yùn)而化熱之象。痰濁聚積、瘀熱互結(jié)在AS發(fā)病過(guò)程中始終存在，日久毒熱凝集，易造成斑塊增生脫落，增加心腦血管系統(tǒng)意外的風(fēng)險(xiǎn)。穩(wěn)消Ⅱ方是霍清萍教授常用的抗AS經(jīng)驗(yàn)方，該方中以水蛭為君藥破血逐瘀消癥，地龍性走竄，為臣藥，具有搜風(fēng)通絡(luò)、活血化瘀之功效，既助君藥?kù)铒L(fēng)活血、化瘀通絡(luò)，亦能平肝止痙、清熱熄風(fēng)，佐以丹參、丹皮涼血活血、清熱解毒化瘀；半夏化痰、燥濕、散結(jié)；郁金行氣活血、涼血解郁，既助水蛭清熱活血，又加強(qiáng)半夏化痰行氣。全方藥簡(jiǎn)力專，以達(dá)活血化瘀清熱、行氣化痰通絡(luò)之效。

課題組前期研究證實(shí)穩(wěn)消Ⅱ方在改善血脂代謝紊亂[12-13]的同時(shí)，可抑制ICVM-1、VCAM-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥指標(biāo)及纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)升高[14-16]，抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)P65蛋白的表達(dá)[4]，其調(diào)脂、抗炎、穩(wěn)定斑塊作用明確，對(duì)肝腎功能無(wú)不良影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)消Ⅱ方可顯著降低總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白，與課題組既往研究結(jié)果相符[12-13]。穩(wěn)消Ⅱ方可通過(guò)激活PPARγ轉(zhuǎn)錄通道，上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制多種炎癥因子表達(dá)，增加斑塊穩(wěn)定性。穩(wěn)消Ⅱ方組、對(duì)照組PPARγ蛋白表達(dá)水平與模型組相比均明顯上升(P<0.05)，提示穩(wěn)消Ⅱ方與辛伐他汀均可上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)水平，穩(wěn)消Ⅱ方上調(diào)PPARγ水平與辛伐他汀相近。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于樣本量偏少，有待于后續(xù)大樣本實(shí)驗(yàn)加以進(jìn)一步論證。