網(wǎng)絡藥理學概念[1]最早于2007年由Andrew L Hopkins在Nature Biotechnology上提出，內容涉及蛋白組學、基因組學、系統(tǒng)生物學、計算生物學和網(wǎng)絡生物學等多學科，是在現(xiàn)代藥理學基礎上建立的以系統(tǒng)生物學為基礎的藥物設計與開發(fā)的新方法。通過構建“藥物-靶點-疾病”關系網(wǎng)絡，運用專業(yè)網(wǎng)絡分析軟件及算法，系統(tǒng)分析成分-靶點關系，從網(wǎng)絡層面觀察中藥成分對疾病靶點的干預與影響，從而闡明中藥多成分、多靶點、多通路的特征。網(wǎng)絡藥理學已成為目前藥物研發(fā)理論方法的熱點[2-3]。

近年來，我國心腦血管病患病率處于持續(xù)上升階段[4]，血栓形成和血栓栓塞是心腦血管病的重要病理過程，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。血小板活化聚集、血液黏度升高等是血栓形成關鍵的病理因素，也是抗血栓藥物的研究方向[5]。中醫(yī)理論中血瘀證見于多種疾病，其臨床表現(xiàn)與現(xiàn)代醫(yī)學的血栓性疾病類似。益氣活血作為血瘀證的治法之一，在治療血栓性疾病中取得了良好的效果。相較于西藥的單靶點、高選擇性，中藥多靶點、多途徑相互作用一直是新藥研發(fā)的熱點。組方中西洋參益氣以助氣行血、丹參活血以免壅滯，且兩藥合用活血而不耗氣、益氣而不壅滯，抗血栓療效明確，因而被廣泛用于防治心腦血管疾病，但是其藥效的物質基礎和作用機制不明，因此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法分析、預測西洋參、丹參組方抗血栓藥效物質基礎、作用靶點及機制，以期為本課題組后續(xù)西洋參、丹參組方抗血栓基礎實驗研究提供參考依據(jù)。

1 方 法

1.1 丹參、西洋參成分潛在靶點網(wǎng)絡構建 Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP數(shù)據(jù)庫)[6]是西北農(nóng)林科技大學王永華教授團隊研發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，為中藥研究提供了新的方法。在數(shù)據(jù)庫中檢索西洋參、丹參所有成分及靶點，通過口服生物利用度(OB)、藥物相似性(DL)進行活性成分篩選。其中西洋參活性成分指標設定為OB>30%、DL>0.18，丹參活性成分篩選指標設定為OB>40%、DL>0.18，再通過Cytoscape3.2.1軟件對成分、潛在靶點進行可視化網(wǎng)絡構建。

1.2 血栓性疾病靶點網(wǎng)絡構建 以“thrombosis”為關鍵詞分別檢索TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫，獲得疾病靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行蛋白基因名的轉換，再通過Cytoscape3.2.1軟件進行疾病靶點可視化構建，利用Bisogenet構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。

1.3 藥物活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡構建 通過Cytoscape3.2.1工具的Merge功能，將以上構建得到的“西洋參、丹參組方成分-潛在靶點網(wǎng)絡”與“疾病靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡”進行Merge分析，得到藥物-疾病共同相關的靶點，映射得到活性成分，進行網(wǎng)絡構建與分析。

1.4 KEGG富集通路可視化分析 利用David數(shù)據(jù)庫將藥物-疾病共同相關靶點進行Go注釋與KEGG富集通路分析，通過OmicShare平臺以高級氣泡圖進行可視化。

2 結 果

2.1 西洋參、丹參組方成分-潛在靶點網(wǎng)絡 本研究基于樣本量和數(shù)據(jù)的復雜性，通過OB、DL參數(shù)作為ADME篩選條件，最終得到50個活性成分構建得到的可視化網(wǎng)絡(見圖1)包含140個節(jié)點和939條邊。

藍色長方形代表靶點；菱形代表成分，綠色為西洋參活性成分，紅色為丹參活性成分。節(jié)點的度表示網(wǎng)絡中與該節(jié)點相連的邊的條數(shù)，每個長方形的度表示與該靶點相關的活性成分的數(shù)目，每個菱形的度則表示該成分可能作用的靶點的數(shù)目

圖1丹參、西洋參成分-潛在靶點網(wǎng)絡圖

2.2 血栓形成性疾病-靶點網(wǎng)絡 33個疾病靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉換為標準基因名，構建可視化網(wǎng)絡(見圖2)及“疾病靶點PPI網(wǎng)絡”(見圖3)，得到714個潛在疾病靶點，共7 046條邊。計算PPI網(wǎng)絡節(jié)點度值中位數(shù)為12，因此以度值大于24的節(jié)點作為疾病核心靶點，構建網(wǎng)絡圖(見圖4)，其中疾病核心靶點共195個。

圖2 疾病-靶點網(wǎng)絡

圖3 疾病靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡

圖4 疾病核心靶點網(wǎng)絡

2.3 藥物活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡構建 “成分-潛在靶點網(wǎng)絡”與“疾病靶點PPI網(wǎng)絡”Merge分析后構建的“成分-靶點網(wǎng)絡” (見圖5)，包括11個藥物-疾病共同的靶點，映射得到34個成分。靶點以菱形表示，活性成分以橢圓表示，顏色越深則度值越大，與其直接相連的節(jié)點越多。節(jié)點間的連接原則為西洋參、丹參組方活性成分靶點與疾病核心靶點相同時，則將活性成分與疾病靶點連接，此靶點即為西洋參、丹參組方中某個活性成分治療血栓性疾病的潛在作用靶點。進一步通過Cytoscape的 Network Analyze、CytoNAC插件對“成分-靶點網(wǎng)絡”進行拓撲分析，計算出度值中位數(shù)為3，然后篩選出度值大于中位數(shù)2倍的節(jié)點作為核心成分靶點網(wǎng)絡節(jié)點，最后構建 “核心成分-靶點網(wǎng)絡”(見圖6)，其中包括5個疾病靶點和8個活性成分。

2.4 KEGG富集通路信息 利用David 對11個靶點進行富集分析，得到10條信號通路(見表1、圖7)，橫坐標表示富集因子，縱坐標表示通路，圓點顏色代表P值，顏色越鮮艷，則P值越小，基因在此通路上的顯著性越高；圓點大小表示基因數(shù)，越大則富集基因數(shù)越多。每條通路上的基因見表1，與血栓形成直接相關的通路是platelet activation(血小板活化)，有3個基因富集在這條通路上，分別是MAPK14，PRKACA，ITGB3，映射得到直接相關的活性成分共16個(見表2、圖8)。

3 討 論

中藥成分多樣、機制復雜，唯有明確其藥效物質基礎及作用機制，才能在中醫(yī)藥寶庫中開發(fā)出更多造福人類的新有效藥。西洋參益氣，丹參活血，二藥合用共奏益氣活血之效，臨床用于治療血栓性疾病，療效明確。本研究利用TCMSP平臺通過ADME參數(shù)篩選西洋參和丹參活性成分，選擇OB和DL作為反映活性成分在體內代謝動力學的參數(shù)。通過設定OB>30%、DL>0.18兩個參數(shù)，得到9個西洋參活性成分、65個潛在疾病靶點。丹參中已知成分202個，因此提高OB值為大于40%，最終得到丹參活性成分41個、72個潛在疾病靶點。去除重復的47個靶點后，最終構建的可視化網(wǎng)絡包含140個節(jié)點、939條相互作用關系。此結果表明，不同成分可以作用于相同靶點，發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用，同一個成分亦可作用于不同靶點，參與不同信號通路，治療不同的疾病。可見，中藥多成分、多靶點、交互作用的特點使其成為新藥研發(fā)的熱點，同時解釋了中醫(yī)異病同治、同病異治法的機制之一[7]。

圖5 成分-靶點網(wǎng)絡

圖6 核心成分-靶點網(wǎng)絡

編號 通路名稱 基因名稱百分比(%)hsa05205Proteoglycans in cancer(癌癥蛋白聚糖)MAPK14 TP53 PRKACA ITGB336.36hsa04924Renin secretion(腎素分泌)KCNMA1 ADRB2PRKACA27.27hsa04970Salivary secretion(唾液分泌)KCNMA1 ADRB2PRKACA27.27hsa04919Thyroid hormone signaling pathway(甲狀腺激素信號通路)TP53 PRKACA ITGB327.27

(續(xù)表1)

編號 通路名稱 基因名稱百分比(%)hsa04611Platelet activation(血小板活化通路)MAPK14 PRKACA ITGB327.27hsa04261Adrenergic signaling in cardiomyocytes(心肌細胞腎上腺素能信號)ADRB2 MAPK14 RKACA27.27hsa05169Epstein-Barr virus infection(人類皰疹病毒感染)MAPK14 TP53 PRKACA27.27hsa04010MAPK signaling pathway(絲裂原活化蛋白激酶信號通路)MAPK14 TP53 PRKACA27.27hsa05014Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)(肌萎縮性脊髓側索硬化癥)MAPK14 TP5318.18hsa04923Regulation of lipolysis in adipocytes(脂肪細胞的脂溶性調節(jié))ADRB2 PRKACA18.18

圖7 11個成分靶點富集通路氣泡圖

表2作用于血小板活化通路靶點的活性成分

編號CAS 名稱口服生物利用度類藥性來源MOL00035883-46-5beta-sitosterol(β-谷甾醇)36.910.75西洋參MOL00698058-74-2Papaverine(罌粟堿)64.040.38西洋參MOL00708835825-57-1/ 4733-35-1Cryptotanshinone(隱丹參酮)52.340.40丹參 MOL007105113472-19-8 Epidanshenspiroketallactone(表丹參螺旋縮酮內酯)68.270.31丹參 MOL00710822550-15-8Isocryptotanshinone(異丹參酮)54.980.39丹參 MOL00704187112-49-0 Miltirone Ⅰ(丹參新酮)40.860.23丹參 MOL007119 N/AMiltiononeⅠ(丹參醌新酮Ⅰ)49.680.32丹參

(續(xù)表1)

編號CAS 名稱口服生物利用度類藥性來源MOL007154568-72-9Tanshinone ⅡA(丹參酮ⅡA)49.890.40丹參MOL00706996839-29-1Przewaquinone c(紫丹參素C)55.740.40丹參MOL00709827468-20-8Deoxyneocryptotanshinone(脫氧基新隱丹參酮)49.400.29丹參MOL002651119963-50-7Dehydrotanshinone Ⅱ A(去氫丹參酮ⅡA)43.760.40丹參MOL007094149817-96-9Danshenspiroketallactone(丹參螺旋縮酮內酯)50.430.31丹參MOL00711120958-15-0Isotanshinone Ⅱ(異丹參酮ⅡA)49.920.40丹參MOL007125109664-02-0Neocryptotanshinone(新隱丹參酮)52.490.32丹參MOL007101125623-97-4DihydrotanshinoneⅠ(二氫丹參酮)45.040.36丹參MOL00715517397-93-2 Tanshinone ⅡB (丹參酮ⅡB )65.260.45丹參

圖8 血小板活化通路成分靶點網(wǎng)絡

益氣活血法在防治心腦血管疾病中具有重要意義，臨床實踐證實益氣活血化瘀中藥能有效防治血栓性疾病的發(fā)生與進展[8-9]，并且通過動物實驗明確其可以在抗血小板聚集、降低血液黏度、改善炎癥狀態(tài)等各方面發(fā)揮抗血栓作用[10-12]。本研究通過網(wǎng)絡篩選得到西洋參、丹參組方活性成分和血栓性疾病靶點，構建含共同靶點的成分-靶點網(wǎng)絡并進行富集通路分析，結果顯示有34個活性成分可以直接作用于11個靶點，涉及10條疾病通路，其中與血栓性疾病最直接相關的通路是platelet activation(血小板活化)，共16個活性成分作用于此通路中3個靶點。其中β-谷甾醇和罌粟堿來源于西洋參，實驗證實β-谷甾醇具有抗炎作用[13]，罌粟堿[14-15]具有擴張血管平滑肌的作用。丹參中作用于血小板活化通路14個成分主要為水溶性紫丹參素C和丹參酮類，包括隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、二氫丹參酮、異丹參酮、丹參新酮、去氫丹參酮ⅡA、異丹參酮ⅡA、新隱丹參酮等，多項實驗證實丹參酮、丹參素具有抗血小板聚集、改善炎癥的作用[16-17]。

血小板活化通路富集的3個靶點分別是MAPK14，PRKACA，ITGB3?；騃TGB3編碼產(chǎn)物是受體糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa receptor，GPⅡb/Ⅲa)，作為血小板膜表面的糖蛋白，其在膜表面大量表達是所有血小板激活通路最核心且最關鍵的一步，每個GPⅡb/Ⅲa有兩個與纖維蛋白原結合位點，其激活后介導血小板與纖維蛋白原結合，促進血小板聚集形成血栓。GPⅡb/Ⅲa是抗血小板藥物研發(fā)最核心的靶點，目前上市的阿昔單抗、依替巴肽、替羅非班臨床療效明確，但是劑型僅限于靜脈制劑，且只在經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術中應用，在血栓性疾病的防治中略顯局限。本研究發(fā)現(xiàn)34個活性成分中隱丹參酮能直接作用于此靶點，且具有較高的口服吸收利用度(52.34%)和類藥性(0.396)，推測隱丹參酮是西洋參、丹參組方合用發(fā)揮抗血栓的成分之一。另外，隱丹參酮還直接作用于MAPK14，推測其可能通過改善炎癥狀態(tài)從而發(fā)揮抗血栓作用。

MAPK14既是編碼基因又是產(chǎn)物蛋白絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)，也叫p38αMAPK，是p38MAPK家族一員，其在環(huán)境應激情況和促炎因子作用下發(fā)生磷酸化進入激活狀態(tài)，激活MAP激酶激活蛋白激酶2(MAP kinase-activated protein kinase 2，MK2)后，通過HSP27、LSP1、CREB、COX-2、ATF1/2/6、SRF、TTP和STAT1、CHOP、MEF2A/C、GATA4、c-Myc、c-FOS等靶點底物介導下游應激相關的轉錄、細胞周期調節(jié)和遺傳毒性應激反應。MAPK14是MAPK家族中在心臟發(fā)揮作用的主要形式，臨床發(fā)現(xiàn)抑制其活性可以緩解缺血性心力衰竭急性損傷[18]，并且在缺血再灌注中有保護心肌的作用[19]，推測其可能具有調節(jié)受損心肌進行細胞分裂的作用。目前正在研發(fā)的針對MAPK14靶點的治療心血管疾病的西藥有Losmapimod、VX-702。本研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、罌粟堿、隱丹參酮、丹參酮ⅡA等12個活性成分可以直接作用于該靶點，提示這些成分可能具有調節(jié)炎癥因子表達、調節(jié)心肌細胞凋亡等作用。

基因PRKACA是蛋白激酶A催化亞基α(catalytic subunit α of protein kinase A，PKA Cα)的編碼基因，PKA最早由Fischer和Krebs發(fā)現(xiàn)并命名，因其激活需要依賴上游激酶通過第二信使cAMP實現(xiàn)，因此也稱為依賴cAMP的蛋白激酶A。PKA是由2個調節(jié)亞基和2個催化亞基組成的四聚體，其起催化作用的亞基α(Cα)負責調節(jié)底物蛋白的磷酸化，主要在心血管疾病、癌癥和某些內分泌紊亂疾病中發(fā)揮作用。有研究提出其磷酸化水平的異常升高會影響心肌正常的興奮收縮耦聯(lián)，導致長QT間期綜合征、心律失常等心臟疾病，甚至發(fā)生心臟猝死[20]。心律不齊會引起血流動力學異常，尤其房顫時最易發(fā)生附壁血栓，血栓脫落后果嚴重，會引起各系統(tǒng)的栓塞，發(fā)生肺栓塞、腦卒中等嚴重不良事件，最嚴重的直接導致心臟猝死。本研究發(fā)現(xiàn)活性成分β-谷甾醇、丹參酮ⅡA、二氫丹參酮和去氫丹參酮ⅡA可以直接作用于PKA Cα，推測西洋參、丹參組方可能通過調節(jié)心肌興奮收縮耦聯(lián)改善心律不齊等會引起血栓形成的心臟節(jié)律疾病，間接發(fā)揮抗血栓作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析西洋參、丹參組方活性成分及血栓靶點之間的關系，發(fā)現(xiàn)西洋參、丹參組方益氣活血組方中生物堿、丹參酮是抗血栓的藥效物質基礎，通過抗血小板活化、抗炎、改善心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)共同發(fā)揮抗血栓作用。為明確網(wǎng)絡藥理學虛擬篩選的結果的準確性，后續(xù)可進行文獻挖掘和基礎實驗，完善對西洋參、丹參組方抗血栓物質基礎與作用機制的研究。