江國強，方 芳

武警四川省總隊醫(yī)院呼吸科 四川樂山 614000

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，也是我國因癌癥而引起死亡的首要因素；近些年其發(fā)病率呈上升和年輕化的趨勢，嚴重威脅人們的健康[1-2]。肺癌的侵襲及轉移是臨床上治療的一大難題。厄洛替尼是一種口服的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，可通過對酪氨酸激酶的靶向抑制而阻斷增殖信號向細胞核的轉導，從而達到抑制細胞增殖的效果；由于厄洛替尼具有良好的安全性及顯著的療效，目前已廣泛應用于臨床[3-4]。有多項研究[5-6]顯示厄洛替尼可聯(lián)合山奈酚、靶向生存素的siRNA等影響肺癌細胞的增殖、凋亡?？等R特注射液是從中藥薏苡仁中提取出來的一種新型的抗腫瘤藥物，對胃癌、胰腺癌等多種腫瘤具有抑制和殺傷作用，可有效抑制腫瘤細胞的生長[7-8]。目前關于厄洛替尼和康萊特聯(lián)合能否產生協(xié)同作用治療肺癌還未可知，因此，作者進行了如下研究，以期為肺癌的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器康萊特注射液(生產批號：1202141-2)購自浙江康萊特藥物有限公司，厄洛替尼購自上海羅氏有限公司(貨號:BDX034001C)；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Invitrogen公司，PVDF膜購自上海羅氏制藥有限公司；Matrigel人工基底膜、Transwell侵襲小室均購自美國Corning公司；Ki-67、E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、JAK2和磷酸化(磷酸化位點Y1007)JAK2(p-JAK2)、STAT3和磷酸化(磷酸化位點Y705)STAT3(p-STAT3)抗體均購自美國Abcam公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2細胞培養(yǎng)人肺癌A549細胞購自上海中科院細胞中心。取出在液氮罐凍存的A549細胞，即刻37 ℃水浴解凍，解凍后細胞在含有體積分數(shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中、于體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每隔2～3 d用胰蛋白酶消化傳代。選擇對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3各組細胞活力的檢測將對數(shù)生長期的A549細胞分為對照組(細胞不經特殊處理)、厄洛替尼組(10 mg/L的厄洛替尼處理)[9]、康萊特組(20 mg/L的康萊特處理)[10]和聯(lián)合組(10 mg/L的厄洛替尼和20 mg/L的康萊特共同處理)。以5×104個/mL的密度(每孔150 μL)接種對數(shù)生長期的細胞于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照上述分組處理，每組設5個復孔。分組培養(yǎng)48 h以后，加入20 μL質量濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清，加入150 μL的DMSO溶液，振蕩混勻10 min，酶標儀測定吸光度值(波長為490 nm)，以吸光度值反映細胞活力。

1.4各組細胞侵襲能力的檢測4 ℃冰箱中將Matrigel基質膠融化，按照1∶6的體積比將融化的基質膠用預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋。在Transwell小室的上室鋪上基質膠100 μL，操作過程中不能產生氣泡，并在37 ℃培養(yǎng)箱中3～5 h以待成膠，將殘留在小室內的液體吸出，每孔加入100 μL預熱的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)1 h。將對數(shù)生長期的A549細胞制備成細胞懸液，按照1.3項分組(每組均設5個復孔)接種。同時在下室每孔加入含血清的培養(yǎng)基500 μL。分組培養(yǎng)48 h，取出小室，棉簽輕輕擦掉上室Matrigel膠及未遷移的細胞，室溫條件下，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，1 g/L結晶紫染色10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，在200倍顯微鏡下選擇5個視野觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取均值。

1.5各組細胞中Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達的Western blot檢測于各處理組(同1.3項的實驗分組)細胞中加入適量的細胞裂解液，BCA法測定總蛋白的濃度。每泳道上樣40 μg，SDS-PAGE后轉PVDF膜、封閉，加Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2、p-STAT3抗體(皆按照1∶500稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，加入稀釋好的二抗，孵育2 h，取出PVDF膜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫條件孵育1.5 h，ECL顯色，暗室中顯影定影。以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用析因設計的方差分析比較厄洛替尼和康萊特單獨或聯(lián)用對肺癌細胞活力，侵襲能力，Ki-67、E-cadherin蛋白及JAK2/STAT3信號通路蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1厄洛替尼和康萊特單獨或聯(lián)用對A549細胞活力和侵襲能力的影響見表1。由表1可知，厄洛替尼或康萊特單獨使用均可抑制A549細胞活力和侵襲能力，二者聯(lián)用后作用增強。

表1 4組細胞活力、細胞侵襲能力的比較(n=5)

2.2厄洛替尼和康萊特單獨或聯(lián)用對A549細胞Ki-67、E-cadherin和MMP-2蛋白表達的影響見圖1、表2。由表2可知，厄洛替尼或康萊特單獨使用均可抑制A549細胞Ki-67、MMP-2的表達，增加E-cadherin蛋白的表達，二者聯(lián)用后該作用增強。

2.3厄洛替尼和康萊特單獨或聯(lián)用對A549細胞JAK2/STAT3信號通路活化的影響見圖2、表3。由表3可知，厄洛替尼和康萊特單獨使用對A549細胞JAK2和STAT3的表達均無影響，但可抑制p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達；二者聯(lián)用后作用增強。

1：對照組；2：厄洛替尼組；3：康萊特組；4：聯(lián)合組

1：對照組；2：厄洛替尼組；3：康萊特組；4：聯(lián)合組

3 討論

有研究[11]顯示，厄洛替尼可有效阻止EGFR跨膜表達受體酪氨酸激酶磷酸化，從而抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡?？等R特是薏苡仁中的一種天然有效的活性成分，具有抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡、阻滯癌細胞分裂等作用，可有效逆轉耐藥和調節(jié)細胞因子[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼和康萊特均能有效抑制A549細胞活力和侵襲能力，兩者聯(lián)用對細胞活力和侵襲能力產生更強的抑制作用，提示厄洛替尼和康萊特可聯(lián)合用于肺癌的治療。

肺癌的增殖及侵襲受到多種基因的影響。JAK2/STAT3信號被激活，可通過影響下游相關分子Ki-67、E-cadherin、MMP-2等影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-15]。Ki-67是一個與細胞增殖關系密切的核蛋白，可作為細胞增殖活性的標記物，由于其檢測較為準確、理想和可靠，目前已得到廣泛應用[16]。E-cadherin為cadherin家族中的一個成員，在腫瘤侵襲、轉移等過程中有重要作用，在多種組織中表達下調，上調其表達能有效地抑制腫瘤的侵襲及轉移[17-18]。MMP-2為MMP家族中重要的一員，其表達與癌細胞的侵襲有關，MMP-2高表達可促進肺癌細胞的侵襲能力，血清MMP-2表達水平也可作為肺癌預后判斷的一個輔助指標[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼和康萊特均可降低A549細胞中Ki-67、MMP-2及JAK2/STAT3信號通路p-JAK2和p-STAT3的表達，上調E-cadherin表達，而聯(lián)用作用更明顯。

綜上所述，厄洛替尼和康萊特均能抑制肺癌細胞活力及侵襲能力，兩者聯(lián)用效果更強，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關。