張 茂，孫浩言，張 磊

宜賓市第一人民醫(yī)院藥劑科 四川宜賓 644000

肺癌是臨床中危害最為嚴(yán)重的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率[1-2]。有研究[3]顯示，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的85%以上[4]。早期NSCLC多不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，確診時(shí)大多已經(jīng)到癌癥晚期，這也極大地增加了臨床治療難度。目前對(duì)NSCLC的治療常采用以鉑類為基礎(chǔ)的化療，但在實(shí)際治療過(guò)程中常因多種因素造成患者對(duì)順鉑(cisplatin，DDP)耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致化療失敗[5]。因此，提高患者對(duì)DDP的敏感性是目前臨床治療中急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNAs，含20～24個(gè)核苷酸[6]。有研究[7-8]報(bào)道m(xù)iRNAs參與癌癥耐藥性產(chǎn)生過(guò)程，如miR-223及miR-192在DDP耐藥的A549細(xì)胞(A549/DDP)中明顯高表達(dá)，降低miR-223或miR-192的表達(dá)可明顯改善A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。miR-21具有致癌作用，可通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制細(xì)胞凋亡[9-10]；有研究[11-12]表明，miR-21異常表達(dá)與惡性腫瘤化療藥物耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究分析了miR-21在DDP敏感和耐藥NSCLC組織中的表達(dá)，并觀察降低miR-21的表達(dá)對(duì)A549/DDP細(xì)胞活性和凋亡的影響，探討miR-21在DDP耐藥性產(chǎn)生中的作用，為NSCLC的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本來(lái)源收集宜賓市第一人民醫(yī)院2016年3月至2017年10月經(jīng)皮肺穿刺法采集的40例NSCLC患者的活檢組織標(biāo)本，所有患者均未接受過(guò)手術(shù)治療且均無(wú)吸煙史。將新鮮的活檢組織標(biāo)本置于液氮中保存?zhèn)溆谩?0例患者中DDP敏感和耐藥各20例；敏感患者DDP聯(lián)合化療效果明顯，預(yù)后良好；而耐藥患者在化療后6個(gè)月內(nèi)癥狀未緩解或出現(xiàn)病情的反復(fù)。試驗(yàn)獲該醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑miR-21抑制劑(anti-miR-21)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。A549及A549/DDP購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC細(xì)胞庫(kù))；新鮮胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、A549/DDP細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作，分別將anti-miR-21及anti-miR-NC轉(zhuǎn)染入A549/DDP細(xì)胞中，48 h后檢測(cè)miR-21的表達(dá)。

1.4miR-21的qRT-PCR檢測(cè)取組織標(biāo)本，A549、A549/DDP、轉(zhuǎn)染anti-miR-21或anti-miR-NC的A549/DDP細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的cDNA，行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：SYBR Ex Taq (2×) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。以U6作為內(nèi)參。miR-21上游引物序列：5’-ACACTCCAGGTGGGTAGCTTAT CAG-3’，下游引物序列：5’-CAACTGGTGTCGTG GAGTTCG-3’；U6上游引物序列：5’-TGCGGGT GCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5DDP對(duì)轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)的測(cè)定將兩組A549/DDP細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL不同濃度(0、30、60、90、120 mg/L)的DDP培養(yǎng)48 h。然后加入5 g/L 的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定490 nm處的吸光度(A)。生長(zhǎng)抑制率=(1-加藥組A/對(duì)照組A)×100%。以最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)將兩組A549/DDP細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后，加入5 g/L的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞凋亡的檢測(cè)將兩組A549/DDP細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，行Annexin V-FITC/PI雙染，避光放置10 min，上流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞中Caspase-3活性的檢測(cè)將兩組A549/DDP細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，按Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定405 nm處的A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較DDP敏感和耐藥患者癌組織中，A549和A549/DDP細(xì)胞中miR-21表達(dá)的差異，以及兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞IC50(DDP)增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1DDP敏感和耐藥患者癌組織中miR-21表達(dá)的比較miR-21在DDP耐藥患者癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(4.56±0.49)高于DDP敏感患者(1.03±0.39)(t=25.208，P<0.001)。

2.2A549和A549/DDP細(xì)胞中miR-21表達(dá)的比較miR-21在A549/DDP中的表達(dá)水平(3.45±0.36)高于A549細(xì)胞(1.02±0.27)(t=24.150，P<0.01)。

2.3兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比較見(jiàn)表1。由表1可知，與anti-miR-NC轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞比較，DDP對(duì)anti-miR-21轉(zhuǎn)染的A549/DDP的IC50降低，細(xì)胞增殖活性降低，凋亡率和Caspase-3活性升高。

表1 兩組轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比較(n=3)

3 討論

miRNAs是一類保守的單鏈非編碼RNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可通過(guò)誘導(dǎo)靶基因的降解調(diào)控靶基因參與的信號(hào)通路，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過(guò)程[13]。不同腫瘤組織中miRNAs的表達(dá)有顯著差異，這些具有腫瘤特異性的miRNA可作為腫瘤早期診斷及個(gè)性化治療的新型生物學(xué)分子標(biāo)志物[14]。有研究[15-16]證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生及化療藥物耐藥密切相關(guān)，而化療藥物耐藥是臨床治療失敗的主要原因。因此，研究miRNAs對(duì)肺癌耐藥性的影響及可能機(jī)制，能夠?yàn)楦纳颇[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果提供依據(jù)。

miR-21是一種具有癌基因作用的功能性miRNA。miR-21可通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制蛋白PDCD4促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[17]；miR-21可通過(guò)靶向抑制人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)、人類錯(cuò)配修復(fù)基因2(hMSH2)，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡[18-19]。除此之外，miR-21還可通過(guò)調(diào)控抗腫瘤藥物的耐藥性影響療效。在耐受性乳腺癌異種移植體中注射miR-21反義寡核苷酸抑制miR-21的表達(dá)可改善乳腺癌對(duì)曲妥珠單抗的敏感性[20]。降低miR-21表達(dá)可抑制低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的表達(dá)，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21在DDP耐藥的NSCLC組織和A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于敏感組織和A549細(xì)胞；抑制A549/DDP細(xì)胞miR-21的表達(dá)可降低DDP對(duì)細(xì)胞的IC50，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高耐藥細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

綜上所述，miR-21有可能成為改善NSCLC患者DDP治療的療效及預(yù)后的新型的作用靶點(diǎn)。