王淑敏，張代群，李 峰，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

目前，免疫治療已經(jīng)成為最具前景的腫瘤治療手段之一，T細胞在腫瘤免疫治療中起到關(guān)鍵作用。然而，在實體瘤腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫逃逸機制，可以識別T細胞表面的免疫檢查點，使T細胞不能對腫瘤細胞進行有效的識別和殺傷，并且走向耗竭狀態(tài)[1]，抑制免疫檢查點可以刺激或增強抗腫瘤免疫應(yīng)答[2]。PD-1存在于活化的T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)上，其配體PD-L1可在腫瘤細胞和樹突狀細胞[3-5]上表達。腫瘤細胞表面的PD-L1分子與T細胞表面的PD-1結(jié)合，可以抑制T細胞的免疫活性；阻斷兩者的結(jié)合，可恢復(fù)T細胞的抗腫瘤作用。成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(Cas9)已經(jīng)成為時下最流行的可以在多種物種中進行基因編輯的工具[6]。相比于傳統(tǒng)重組鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)等技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)具有操作簡單、效率高、成本低的優(yōu)點[7]。利用CRISPR/Cas9對人原代T細胞進行基因編輯，為基于T細胞的免疫治療提供了巨大的應(yīng)用前景[8]，但CRISPR/Cas9編輯體系會對細胞活性造成一定損害。目前最普遍應(yīng)用的是Lonza公司的4D-Nuleofector儀器，其配有不同的電轉(zhuǎn)緩沖液和脈沖組合，可針對各種類型的細胞進行電穿孔[9]。本文根據(jù)文獻報道和前期研究[9-10]，設(shè)計兩種電轉(zhuǎn)緩沖液和脈沖組合方案，檢測兩種方案編輯CD8+T細胞PD-1基因的效率，比較兩種方案對T細胞生物學特性的影響，旨在篩選出一種更適合T細胞基因編輯的電穿孔條件。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，CD3單抗、CD28單抗、高保真DNA 聚合酶、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、Cas9核酸酶購自美國Thermo Fisher Scientific公司，T7核酸內(nèi)切酶1(T7E1)和BbsⅠ酶購自美國NEB公司，流式熒光抗體均購自美國Biolegend公司，重組人IL-2購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，蛋白酶K、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，RNA純化試劑盒購自美國Zyom Research公司，T4 DNA連接酶、Stabl3感受態(tài)細胞、Premix Taq、基因組DNA提取試劑盒和Primer STAR聚合酶均購自日本TaKaRa公司，DNA純化試劑盒購自美國Axygen公司，電轉(zhuǎn)儀和電轉(zhuǎn)緩沖液均購自瑞士Lonza公司，質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)購自美國Addgene公司，人胚腎293T細胞購自中國科學院細胞所。

1.2PD-1sgRNA序列及引物的設(shè)計與合成使用在線工具http://crispr.mit.edu/設(shè)計3條PD-1 sgRNA序列，使用NCBI網(wǎng)站的Primer-blast在線設(shè)計3條PD-1 T7E1檢測引物及PD-1 vitro上下游引物、PX458 check檢測引物。PD-1 T7E1檢測引物設(shè)計在編輯位點的上游150～200 bp和下游350～400 bp處(反之亦可)。所有序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 sgRNA及引物序列

1.3靶向PD-1重組PX458質(zhì)粒的構(gòu)建按圖1模式構(gòu)建質(zhì)粒。用BbsⅠ酶線性化PX458質(zhì)粒，并使用DNA純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，檢測濃度。將合成好的sgRNA單鏈混合并稀釋至1 mol/L，退火形成雙鏈，按照sgRNA∶線性PX458質(zhì)粒物質(zhì)的量比為5∶1混合，然后加入1 μL T4 Ligation buffer、1 μL T4 DNA連接酶，終體積為10 μL，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stabl3感受態(tài)細胞，涂布于帶有氨芐青霉素的平板，挑取單個克隆至含有LB肉湯培養(yǎng)基和氨芐青霉素的2 mL離心管中，在37 ℃、250 r/min水平搖床中培養(yǎng)2～3 h，然后做菌液PCR。PCR體系：1.5 μL菌液，1.0 μL PX458 check上游引物，1.0 μL PD-1 sgRNA下游引物，10.0 μL Premix Taq，無菌水6.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保持。將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，選擇能擴增出單一且明亮條帶的菌液，轉(zhuǎn)移至搖菌管中，37 ℃搖床中220 r/min過夜，抽提質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司測序驗證。

圖1 重組質(zhì)粒示意圖

1.4293T細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將處于對數(shù)生長期的293T細胞以4×105個/孔的密度接種到6孔板，在含高糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清)、體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達到70%左右開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基對細胞進行“饑餓”處理，用Lipofectamine 3000將1.3中構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞中，以空PX458質(zhì)粒為陰性對照。

1.5PD-1切割效率的檢測轉(zhuǎn)染48 h后，消化293T細胞，用PBS洗3次，按照試劑盒說明書操作提取基因組DNA，使用Primer STAR聚合酶和PD-1 T7E1檢測引物進行PCR，擴增編輯位點的DNA片段。以純化后的PCR產(chǎn)物為模板行PCR。反應(yīng)體系：DNA片段200 ng，10×NE Buffer 2 μL，無核酸酶水補充至19 μL，行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95～85 ℃(按2 ℃/s梯度程序降溫至85 ℃)，85～25 ℃(按0.1 ℃/s梯度程序降溫至25 ℃)。然后加入1 μL T7E1酶切15 min，立即行20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照觀察。若靶點被CRISPR/Cas9成功編輯，經(jīng)PD-1 T7E1酶切，電泳結(jié)果會呈現(xiàn)3條帶，大小分別約為600、400和200 bp。用Image J軟件對條帶進行灰度分析，計算切割效率。切割效率=(200 bp條帶灰度值+400 bp條帶灰度值)/3條條帶灰度值總和×100%。

1.6sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄及活性驗證以插入PD-1 sgRNA2的重組PX458質(zhì)粒為模板，加入PD-1 vitro上、下游引物，PCR擴增出體外轉(zhuǎn)錄模板，用DNA純化試劑盒純化。參照說明書，用T7E1體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將模板轉(zhuǎn)錄成RNA，用RNA純化試劑盒對sgRNA進行純化，于-80 ℃保存。

以293T細胞基因組為模板，用T7E1檢測引物進行PCR和凝膠電泳，回收產(chǎn)物并純化，以產(chǎn)物為模板行PCR。擴增體系19 μL，包括10×Cas9 Buffer 2 μL體外轉(zhuǎn)錄的2 μmol/L sgRNA 2 μL，1 μmol/L的Cas9 2 μL，適量去核酸酶水，室溫孵育10 min，模板DNA0.2 pmol，37 ℃孵育30 min之后再加入1 μL蛋白酶K，37 ℃反應(yīng)15 min，進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀拍照，用Image J軟件對條帶進行灰度分析。以切割效率反映sgRNA活性，計算方法同1.5。

1.7CD8+T細胞電穿孔條件外周血單個核細胞的分離、CD8+T細胞的分選、培養(yǎng)和活化見參考文獻[11]。收集活化后的CD8+T細胞，離心棄上清。將3 μg sgRNA和3 μg Cas9室溫(25 ℃)共孵育10min，用電轉(zhuǎn)染緩沖液稀釋，用此稀釋液重懸CD8+T細胞至3×104個/μL，轉(zhuǎn)移到100 μL的電轉(zhuǎn)杯中，在Lonza 4D-Nuleofector儀器中分別用方案一(P2電轉(zhuǎn)染緩沖液+EH100脈沖)、方案二(P3電轉(zhuǎn)染緩沖液+EO115脈沖)進行電穿孔。以只加Cas9未加sgRNA的細胞為對照。所用的電轉(zhuǎn)染緩沖液均為Lonza公司原廠包裝，脈沖均為Lonza 4D-Nuleofector儀器內(nèi)置程序。電穿孔后的細胞用37 ℃預(yù)熱的含有300 IU/mL IL-2、體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于24孔培養(yǎng)板中在體積分數(shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.8電穿孔后CD8+T細胞活性及PD-1敲除效率、分化狀態(tài)和增殖能力的檢測以未電穿孔的細胞為對照組，分別用1.8項兩種方案(方案一組、方案二組)對活化3 d的CD8+T細胞進行電穿孔，以敲除PD-1。①繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收取細胞，加入7AAD-PerCP流式抗體，檢測細胞活性。②電穿孔后的細胞培養(yǎng)3 d后，再次加入CD3單抗、CD28單抗刺激6 h，加入抗人CD8-APC-Cy7、PD-1-FITC、7AAD-PerCP流式抗體，在4 ℃條件下避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。PD-1敲除效率=(對照組PD-1表達量-實驗組PD-1表達量)/對照組PD-1表達量×100%。③分別取3組CD8+T細胞1×105個/管，加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-APC、CCR7-PE，4 ℃避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測。CD45RO-CCR7+為初始T細胞(Tn)，CD45RO+CCR7+為中心記憶性T細胞(Tcm)，CD45RO-CCR7-為效應(yīng)T細胞(Teff)，CD45RO+CCR7-為效應(yīng)記憶性T細胞(Tem)。④分別將3組CD8+T細胞按照5×106個/孔鋪于12孔板中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2、4、6和8天收取細胞，混勻后吸取10 μL于血球計數(shù)板計數(shù)，計算增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)=終細胞數(shù)/初始細胞數(shù)。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗分析3組CD8+T細胞活性、細胞增殖倍數(shù)的差異，應(yīng)用t檢驗比較兩種方案PD-1敲除效率的差異，檢驗水準α=0.05 。

2 結(jié)果

2.1靶向PD-1的PX458重組質(zhì)粒測序結(jié)果及PD-1抑制效率測序結(jié)果見圖2。T7E1核酸內(nèi)切酶法驗證果見圖3。由圖3可知，sgRNA1、2、3介導(dǎo)的PD-1基因切割效率分別為60.32%、68.61%、40.96%，其中PD-1 sgRNA2切割效率最高。體外轉(zhuǎn)錄sgRNA2對293T細胞PD-1基因的切割效率達93%(圖4)。

2.2方案一、二組PD-1敲除效率的比較結(jié)果見圖5。方案一組敲除效率[(87.70±1.03)%]明顯高于方案二組[(70.13±2.13)%](t=7.440，P=0.002)。

上、中、下：PD-1-sgRNA1-PX548、PD-1-sgRNA2-PX548和PD-1-sgRNA3-PX548測序結(jié)果

圖2測序結(jié)果

M：Marker；0：陰性對照；1、2、3：PD-1 sgRNA1、2、3

M：Marker；0：陰性對照；1：PD-1 sgRNA2

A：方案一對照組；B：方案一實驗組；C：方案二對照組；D：方案二實驗組

2.3電穿孔后CD8+T細胞活性結(jié)果見圖6。對照組[(1.07±0.15)%]、方案一組[(1.24±0.13)%]和方案二組[(1.56±0.28)%]死細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(F=4.657，P=0.060)。

A：對照組；B：方案一組；C：方案二組

2.43組CD8+T細胞分化狀態(tài)的比較見圖7、表2。3組CD8+T細胞的分化狀態(tài)差異無統(tǒng)計學意義。

A：對照組；B：方案一組；C：方案二組

表2 3組CD8+T細胞分化狀態(tài)的比較(n=3) %

2.53組CD8+T細胞增殖倍數(shù)的比較見表3。由表3可知，3組細胞增殖倍數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。

表3 3組CD8+T細胞增殖倍數(shù)的比較(n=3)

3 討論

T細胞可以通過抗原提呈細胞特異性識別腫瘤細胞表面抗原，并有效地殺傷腫瘤細胞，然而，腫瘤微環(huán)境中存在復(fù)雜的機制，使抗腫瘤免疫反應(yīng)延遲、改變甚至停止[12]，即“免疫逃逸機制”。免疫逃逸導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)不能有效識別并殺傷腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤生長失去控制而處于異常過度增殖狀態(tài)[13]。通過抑制這些免疫檢查點來解除患者免疫抑制狀態(tài)，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，目前被認為是最有前景的腫瘤治療方法之一。

已有文獻[14-17]報道使用Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄或合成的sgRNA形成的復(fù)合物進行電穿孔可以有效地對人原代T細胞進行基因編輯。CRISPR/Cas9作為一種基因編輯技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用，該技術(shù)具有許多明顯的優(yōu)勢：沒有物種限制；基因編輯方式多樣(敲除、插入[18]、抑制、激活等)；可實現(xiàn)對多個靶基因同時編輯；操作較簡單，且編輯效率高[12]。利用該技術(shù)對T細胞進行基因編輯，如敲除一個或多個免疫檢查點，之后進行過繼回輸，可以減少免疫抑制的發(fā)生，增強T細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]。然而向T細胞中遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)的方法有很多種，但基因編輯效率及基因編輯后對T細胞活性的影響還有待優(yōu)化。因此本研究采用Lonza公司的4D-Nuleofector儀器遞送靶向T細胞PD-1的CRISPR/Cas9蛋白，根據(jù)已有文獻報道和本實驗室前期實驗，選擇兩種該儀器配有的電轉(zhuǎn)染緩沖液和脈沖組合進行對比，即方案一(P2電轉(zhuǎn)染緩沖液 + EH100脈沖)與方案二(P3電轉(zhuǎn)染緩沖液 + EO115脈沖)，通過檢測細胞上PD-1基因編輯效率及編輯后細胞活性、分化與增殖，鑒定出P2電轉(zhuǎn)染緩沖液和EH100脈沖的組合是一種更加高效的電穿孔條件，可以有效地提高T細胞基因編輯效率并且不會影響T細胞的活性、分化和增殖。