楊和君，柯瑞盛，江哲龍，張小進(jìn)，蔡秋程，沈佳佳，潘凡，張坤， 江藝，呂立志（.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 35005；.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，福建 廈門 36003）

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，即小肝癌（直徑≤5 cm）， 肝癌切除術(shù)后總體治療效果也欠佳［1］。肝移植是目前肝癌最有效的根治性手段［2］。但由于供肝短缺的現(xiàn)狀，Majno 等［3］提出針對(duì)小肝癌治療的補(bǔ)救性肝移植（salvage liver transplantation，SLT）概念，即對(duì)肝功能良好符合“米蘭標(biāo)準(zhǔn)”的HCC，首先采取肝癌切除治療，術(shù)后肝癌肝內(nèi)復(fù)發(fā)（標(biāo)準(zhǔn)同上）或出現(xiàn)肝功能衰竭時(shí)再行肝移植的治療策略。尋找與HCC 肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)制定肝癌肝移植的手術(shù)適應(yīng)證和改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義［4］。研究發(fā)現(xiàn)剪接因子是癌癥發(fā)展中的重要參與者［5］。HNRNPA1 是其中的一種剪接因子，近年來(lái)對(duì)于HNRNPA1 參與腫瘤的進(jìn)展常有報(bào)道［6］。目前對(duì)HNRNPA1 在小肝癌補(bǔ)救性肝移植肝癌組織中表達(dá)情況及其預(yù)后關(guān)系尚未清楚。本研究中實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合生物信息學(xué)分析HNRNPA1 表達(dá)與補(bǔ)救性肝移植患者預(yù)后的意義，并用GSEA 基因富集分析HNRNPA1 表達(dá)可能涉及到的生物學(xué)過(guò)程。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2013 年1 月— 2016 年1 月第九〇〇醫(yī)院肝膽外科接受小肝癌切除術(shù)，肝癌復(fù)發(fā)后又行補(bǔ)救性肝移植手術(shù)治療12 例患者的前后兩次肝癌組織（-80℃凍存），運(yùn)用qRT-PCR 法檢測(cè)肝癌組織中HNRNPA1 蛋白表達(dá)是否存在變化。 回顧性分析2005 年1 月—2013 年12 月在本中心 因肝癌復(fù)發(fā)施行同種異體經(jīng)典原位肝移植且經(jīng)病 理證實(shí)的肝癌組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其 表達(dá)。所有入組患者研究前均獲得患者本人和家屬的知情同意，并獲得第九〇〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批 準(zhǔn)（2013-003）。入組患者均符合“米蘭標(biāo)準(zhǔn)”的肝癌肝移植患者，移植前曾行肝腫瘤切除術(shù)，并排除臨床資料保存不完整及術(shù)后3 個(gè)月內(nèi)死于并發(fā)癥的患者。共收集滿足以上條件的病例68 例?；颊呤中g(shù)方式及移植術(shù)后治療方案和隨訪方法，均與本中心既往報(bào)道相類似［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及試劑

1.2.1 主要試劑：Trizol 試劑、Real-time PCR SYBR Green 試 劑 盒、逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Aidlab 公 司）。 寡聚核苷酸引物：內(nèi)參β-actin、目的基因 HNRNPA1 均由上海英駿公司設(shè)計(jì)合成，引物 序列如下：HNRNPA1：5‘- TTTGACGACCATGACT CCGT-3’（forward）和 5‘- CACGACCACCACCAAA GTTT-3（reverse）；β-actin：5’-AGCGAGCA TCCCCCAAAGTT-3’（forward）和5’-GGGCACGAA GGCTCATCATT-3’（reverse）?？故罂谷薍NRNPA1單克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 多聚體試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑（福州邁新公司）。

1.2.2 取-80 ℃冰箱中保存的新鮮冰凍組織，按Trizol 試劑說(shuō)明書，提取組織的RNA，使用Nanodrop 測(cè)定RNA 的純度（OD260／OD280）和濃度。取1μg Total RNA，應(yīng)用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 的第一鏈，TaKaRa 公司 SYBR Green 試劑盒，按照說(shuō)明書冰上加樣，實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照用雙蒸水代替模板，以β-actin 作對(duì)照，檢測(cè)HNRNPA1 基因的表達(dá)情況，基因定量經(jīng)ABI7900 熒光定量PCR 儀檢測(cè)，反應(yīng)條件設(shè)置為預(yù)變性 95 ℃30 s，PCR 反應(yīng)94℃ 4 min；94℃ 30 s， 56℃ 30 s，72℃ 25 s，30 個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 40 個(gè)循環(huán)；降溫 50 ℃ 30 s。用2-△△Ct值表示HNRNPA1 表達(dá)在肝癌組織中的表達(dá)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法：將石蠟包埋的組織標(biāo)本連續(xù)切成厚度為4 μm 的薄片，60 ℃烤片，二甲苯脫蠟15 min，依次浸泡在無(wú)水乙醇、90%乙醇、85%乙醇中各3 min，再浸泡于新鮮配制的3%過(guò)氧化氫溶液15 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。置于1 ∶50 乙二胺四乙酸溶液中95 ℃下行微波抗原熱修復(fù)15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS） 處理20 min 后，用4%胎牛血清封閉液37 ℃下孵育30 min，然后滴加PBS 稀釋的HNRNPA1 抗體（1 ∶100），37 ℃ 下孵育30 min，4 ℃過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 多聚體試劑盒對(duì)組織切片進(jìn)行二級(jí)免疫反應(yīng)，滴加新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺顯色劑后， 顯微鏡下控制反應(yīng)顏色，流水沖洗6 min，蘇木素復(fù)染30 s，流水沖洗10 min，60 ℃烤箱內(nèi)烘干后中性樹脂封片。陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞核和／或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)。結(jié)果采用Greenspan 半定量 法［8］，評(píng)分≤3 為陰性，＞3 分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用率表示。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher 確切概率法。生存曲線以Kaplan-Meier 法完成并以Log-Rank 檢驗(yàn)。采用Cox 回歸模型分別進(jìn)行單因素和多因素分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 隨訪結(jié)果：本研究所有68 例患者均完成隨訪，隨訪截止至2017 年5 月30 日，其中男性65 例， 女性3 例，中位年齡為49（22 ～73）歲，腫瘤平均直徑為2.9 （0.6 ～ 5.0）cm；5 年總累積生存率為27.94%（19 例），隨訪期間無(wú)復(fù)發(fā)34 例（50%），生存期隨訪中位時(shí)間為50（11 ～125）個(gè)月； 共復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移34 例（50%），復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)間為術(shù)后 2 ～55 個(gè)月。

2.2 小肝癌組織中HNRNPA1 的表達(dá)：肝癌組織qRT-PCR 結(jié)果顯示，12 例肝癌患者兩次手術(shù)的肝癌組織及癌旁組織（n=24）mRNA 表達(dá)水平存在差異（P ＜0.001，圖1A）。12 例患者的肝切除癌組織與相應(yīng)肝移植癌組織比較HNRNPA1 蛋白表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.618，圖1B）， 提示同一患者前后兩次手術(shù)的肝癌組織中HNRNPA1 蛋白表達(dá)變化不存在明顯差異。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：HNRNPA1 蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞核，部分位于細(xì)胞漿（圖1C 和D）。68 例補(bǔ)救性肝移植患者的肝癌組織中HNRNPA1 陽(yáng)性表達(dá)42 例（61.76%），癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)13 例（19.12%），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kaplan-Meier 分析顯示肝癌組織HNRNPA1 高表達(dá)與患者肝移植術(shù)后累積復(fù)發(fā)率及累積生存率的關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001，見(jiàn)圖1E 和F）。

2.3 HNRNPA1 表達(dá)與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系：HNRNPA1 表達(dá)與患者的腫瘤包膜、血管侵犯、腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)（P ＜0.05），結(jié)果詳見(jiàn)表1。

2.4 HNRNPA1 表達(dá)與肝移植患者預(yù)后的關(guān)系： 肝癌肝移植患者的1、3、5 年累積復(fù)發(fā)率及累積生存率見(jiàn)表2。COX 多因素分析顯示患者累計(jì)生存率與HNRNPA1 高表達(dá)（P=0.002，HR=3.381，95% CI=1.561 ～7.320）、血管侵犯（P=0.020， HR=2.278，95% CI=1.138 ～4.559）密切相關(guān)； COX 多因素分析結(jié)果顯示患者的累積復(fù)發(fā)率與HNRNPA1 的 高 表 達(dá)（P = 0.001，HR = 4.550，95% CI=1.932 ～10.718）、腫瘤包膜（P=0.044， HR=2.171，95%CI=1.022 ～4.610）相關(guān)。

圖1 肝癌組織中HNRNPA1 的表達(dá)

3 討 論

肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)不僅與腫瘤本身臨床特征、移植術(shù)后免疫抑制劑使用等因素相關(guān)，還涉及多個(gè)基因產(chǎn)物參與的復(fù)雜過(guò)程，共同決定腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能的異質(zhì)性［9］。如能在早期肝癌患者中發(fā)現(xiàn)合適的生物學(xué)標(biāo)志物，有望為肝癌肝移植患者的診療提供新的依據(jù)。

表1 HNRNPA1 陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性（例）

HNRNPA1 在消化系統(tǒng)腫瘤中已有不少研究報(bào)道，主要集中在分子作用機(jī)制方面［10］。既往相關(guān)研究主要以肝癌切除術(shù)患者為研究對(duì)象，較少關(guān)注早期肝癌移植患者，本研究主要結(jié)合生物信息學(xué)分析對(duì)早期小肝癌中的HNRNPA1 表達(dá)進(jìn)行研究。HNRNPA1 在人體各個(gè)組織器官中均有分布［6，11］，其選擇性剪接調(diào)節(jié)在整個(gè)人類轉(zhuǎn)錄組中普遍存在，通過(guò)與其他剪接因子協(xié)同作用［12］，并與細(xì)胞核中多種生物活動(dòng)及細(xì)胞的增生轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)［13］，HNRNPA1 的表達(dá)量發(fā)生改變，并參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)生和轉(zhuǎn)移［14］，其在各種類型腫瘤中高表達(dá)可作為早期腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物［15-16］。既往研究報(bào)道HNRNPA1 通過(guò)激活EGFR/MAPK/ERK 通路來(lái)調(diào)控胰島素受體的剪接形式，或激活Ras/MAPK/ERK 通路調(diào)控功能性A-Raf 基因的剪接體來(lái)刺激腫瘤增殖［17］。同時(shí)HNRNPA1 高表達(dá)后可通過(guò)調(diào)控CD44v6 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HCC 侵襲，可以作為肝癌切除術(shù)患者預(yù)后標(biāo)志物［11，16］，最新研究發(fā)現(xiàn)在HBV 相關(guān)的HCC 中HNRNPA1 是miR-22 的直接靶基因，并且HNRNPA1 可能通過(guò)EGFR 信號(hào)通路起到癌基因的作用［6］，本研究首次報(bào)道小肝癌組織中HNRNPA1 高表達(dá)。HNRNPA1 高表達(dá)與患者的腫瘤包膜、血管侵犯、腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，COX 回歸分析結(jié)果顯示HNRNPA1 高表達(dá)是小肝癌補(bǔ)救性肝移植預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與既往研究結(jié)果相 類似［16］。

表2 肝癌肝移植患者的1、3、5 年累積復(fù)發(fā)率及累積生存率

HNRNPA1 可能參與HCC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并與補(bǔ)救性肝移植患者不良預(yù)后相關(guān)。由于本研究為單中心回顧性研究，因此上述結(jié)論仍需大樣本及多中心臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。