梁瓊仙，胡 波，張海紅，譚曉軍廣東省開平市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 開平 59300；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院//廣州華僑醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 50000

腎細胞癌是眾多惡性腫瘤中的一種，男性腎癌患者患病率約為女性患者的2倍，屬于泌尿生殖系統(tǒng)中的高發(fā)惡性腫瘤[1-2]。近年來，腎癌的檢出率逐年增加[3-4]。目前針對腎癌的治療方案主要為外科手術(shù)治療，但是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是阻礙腎癌治療進展的絆腳石，甚至20%的初診腎癌患者已為腫瘤晚期，錯失手術(shù)治療的最佳良機[5]?；?、放療為惡性腫瘤的重要治療方案，與外科手術(shù)切除療法并駕齊驅(qū)，但腎癌對放療及系統(tǒng)療法（基于IL-2及IFN-γ的激素療法、化學(xué)療法及免疫療法）不敏感甚至耐藥，大大增加治療難度[2,6]。BET超家族包括BRD1、BRD2、BRD4及BRDT 4種蛋白質(zhì)，具有相似的空間結(jié)構(gòu)，可通過結(jié)合染色體上乙?；馁嚢彼峤閷?dǎo)染色體重排或調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)BET超家族蛋白在腎癌細胞中表達量高，促進腎癌細胞增殖、侵襲及遷移，是治療腎癌的一個潛在靶點[9]。CPI203是一種BET超家族的特異性小分子抑制劑，前期研究發(fā)現(xiàn)CPI203可在體內(nèi)外抑制多種惡性腫瘤細胞增殖，其中包括淋巴瘤、急性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚鱗癌及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等[10-14]。CPI203小分子抑制劑可通過調(diào)控多種癌基因表達水平進而影響惡性腫瘤細胞的增殖、生長及侵襲。至今，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于CPI203對腎癌細胞增殖影響的研究。本實驗通過探索CPI203對腎細胞癌的殺傷作用，并針對其影響機制進一步深究，為探尋腎癌新藥物治療夯實一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ACHN細胞（ATCC），小分子抑制劑CPI203（Selleckchem），PBS緩沖液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、普通胰酶等試劑（BI），熒光定量PCR引物（上海生工生物工程公司合成提供），CCK-8檢測試劑盒（Dojindo），逆轉(zhuǎn)錄及TBGreen試劑盒（Takara），免疫印跡實驗抗體（ProteinTech）。

1.2 細胞培養(yǎng)

腎癌ACHN細胞以普通培養(yǎng)基（含10%FBS的DMEM）于37 ℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嚴密注意細胞生長情況，當(dāng)細胞增殖至密度達培養(yǎng)瓶80%左右時，傳代培養(yǎng)。后續(xù)所有細胞實驗均建立在對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞上進行實驗。

1.3 小分子抑制劑CPI203藥物溶液配制

CPI203用細胞級別的DMSO充分溶解，先配制成100 μmol/L濃度的母液并保存于-80 ℃冰箱中。細胞實驗前用完全培養(yǎng)基將藥物母液稀釋成實驗需要的工作液濃度。

1.4 腎癌ACHN細胞存活率檢測

取生長狀態(tài)良好的ACHN細胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細胞密度為5×104/mL，以每孔100 μL的細胞懸液接種于96孔板中，將培養(yǎng)板置于細胞孵箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)實驗計劃需求，將培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)基更換為CPI203藥物溶液，濃度分別為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L，設(shè)立空白組及對照組，每個濃度設(shè)立4個復(fù)孔。CPI203藥物作用于腎癌ACHN細胞24、48 h后，96孔板中每個孔按照CCK8試劑盒說明書指示加入10 μL CCK8溶液，將96孔板放入細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)板吸光度A450nm并計算細胞存活率。

1.5 細胞劃痕實驗

取生長狀態(tài)良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，放回普通細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達培養(yǎng)板的90%～100%時，用高壓滅菌過的200 μL中槍頭迅速地在細胞中劃痕，然后將細胞培養(yǎng)基更換為CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基。分別于藥物作用0、48 h后于倒置顯微鏡下拍照，觀察細胞遷移及侵襲能力。

1.6 細胞周期實驗

取生長狀態(tài)良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，將培養(yǎng)板放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回細胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，充分洗滌后加入75%乙醇固定液固定，放置于4 ℃冰箱過夜。PBS充分洗滌后加入500 μL PI重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.7 細胞凋亡實驗

取生長狀態(tài)良好的ACHN細胞備用，將腎癌細胞懸液密度調(diào)整為1×106/mL，以1 mL/孔的細胞懸液接種于6孔板中，將培養(yǎng)板放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放回細胞孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，用PBS充分清洗后加入100 μL bindingbuffer重懸細胞，然后分別加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 細胞克隆形成實驗

取生長狀態(tài)良好的ACHN細胞以500/孔接種于6孔板中，細胞繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng)24 h后將細胞培養(yǎng)基更換為小分子抑制劑CPI203藥物濃度為0、0.1、0.5、1 μmol/L及5 μmol/L的培養(yǎng)基，將細胞放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后用PBS充分洗滌，細胞固定液固定1 h后充分清洗，倒置顯微鏡下計算克隆形成數(shù)目。

1.9 免疫印跡法檢測MYC、GSK3β、ERK、AKT、CyclinD1和NOXA蛋白水平

收集不同CPI203藥物濃度處理的腎癌ACHN細胞并充分洗滌，加入適量強效細胞裂解液，4 ℃條件下裂解20 min，提取全細胞蛋白并利用BCA法測定蛋白濃度。提前配制好適宜濃度的SDS-PAGE膠，每個泳道加入40 μg蛋白，80 V恒壓電泳約30 min后轉(zhuǎn)換為120 V恒壓電泳約1 h；恒流200 mA濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜置于5% BSA溶液中封閉2 h；分別將PVDF膜置于4 ℃冰箱中中孵育相應(yīng)一抗溶液，過夜；0.1%吐溫的TBS-T洗滌一抗4次，10 min/次；室溫下孵育二抗1 h；TBS-T漂洗二抗3次，6 min/次；將PVDF膜稍微瀝干后加入ECL發(fā)光液，放置于WB成像系統(tǒng)中顯影成像。

1.10 qRT-PCR

用TRIzol裂解細胞并按照試劑盒說明書指示提取細胞總RNA，嚴格按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TBGreen說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行熒光定量檢測。qRT-PCR引物序列見表1。內(nèi)參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.11 統(tǒng)計方法

對計數(shù)資料及計量資料均采用雙側(cè)檢驗分析，采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，參數(shù)檢驗及非參數(shù)檢驗分別采取t檢驗和χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 CPI203抑制腎癌ACHN細胞增殖

不同濃度CPI203藥物作用于ACHN細胞48 h后，腎癌細胞增殖活性受到不同程度抑制（表2）。0.1～5 μmol/L濃度的CPI203作用于ACHN細胞24 h后細胞增殖活性從87.29%降至52.61%，相同濃度的CPI203藥物作用于腎癌ACHN細胞的時間越長，細胞增殖活性下降（P＜0.05，表2）。

表2 CCK8法檢測CPI203抑制ACHN細胞增殖效果（%，Mean±SD）

2.2 CPI203抑制腎癌ACHN細胞侵襲及遷移能力

ACHN細胞劃痕實驗結(jié)果表明，隨著CPI203藥物濃度的增大，細胞遷移距離明顯變小（P＜0.05，圖1）。

圖1 ACHN細胞劃痕實驗

2.3 CPI203藥物抑制腎癌ACHN細胞生長周期并促進其凋亡

不同濃度小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞24 h后其細胞周期及凋亡情況。實驗結(jié)果顯示，小分子抑制劑CPI203濃度越大，ACHN細胞G0/G1期比例增加，G2/M和S期占比均比對照組細胞小，細胞凋亡率也隨著藥物濃度增大而升高（P＜0.05，圖2）。

2.4 熒光定量PCR

CPI203作用于腎癌ACHN細胞后減弱MYC基因、NOXA基因、AKT基因、ERK基因、GSK3β基因及CyclinD1基因的表達量（P＜0.05，圖3）。

2.5 CPI203抑制腎癌ACHN細胞克隆形成能力

未加小分子抑制劑CPI203的ACHN細胞形成明顯的細胞克隆集落，隨著藥物濃度的增大，腎癌ACHN細胞克隆集落形成能力逐漸減弱（P＜0.05，圖4）。

2.6 Western blotting結(jié)果

CPI203作用于腎癌ACHN細胞后降低MYC蛋白、NOXA蛋白、AKT蛋白、ERK蛋白、GSK3β蛋白及CyclinD1蛋白的表達量（P＜0.05，圖5）。

圖2 不同濃度CPI203藥物對腎癌ACHN細胞周期（A）及凋亡（B）的影響*P＜0.05

圖3 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞后相關(guān)基因表達的影響

圖4 不同濃度CPI203藥物對腎癌ACHN細胞克隆形成能力的影響

圖5 小分子抑制劑CPI203作用于腎癌ACHN細胞后相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

腎癌細胞對化療和放療敏感性弱，并且患者病情容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)難治，眾多科學(xué)家為了克服此困難一直致力于探索治療腎癌的新藥物[15-17]。文獻報道CPI203具有抑制胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤增殖，促進其癌細胞凋亡并將腫瘤細胞抑制于細胞周期G1期，從而對腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用[15]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CPI203具有抑制腎癌ACHN細胞生長增殖能力，并且其抑制效果與藥物作用時間呈正相關(guān)性。CPI203小分子抑制劑具有抑制腎癌ACHN細胞侵襲、遷移的能力，表明該小分子抑制劑在體內(nèi)具有抑制腎癌腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力。流式細胞儀檢測結(jié)果表明隨著CPI203藥物濃度的增加，腎癌ACHN細胞發(fā)生凋亡的比例增大，表明腫瘤細胞的凋亡率與CPI203藥物呈濃度依賴性。細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1是一種重要的細胞周期素，嚴格地調(diào)控著細胞G1期的合成，主要作用于G1/S調(diào)定點并調(diào)控著細胞G1期向S期的進展。CyclinD1過多將縮短G1期，細胞將減弱對外源性有絲分裂的依賴并進入細胞分裂[18]。CyclinD1下降將把細胞周期抑制于G1期，有利于腫瘤的治療。

本實驗結(jié)果表明，小分子抑制劑CPI203可抑制腎癌ACHN細胞CyclinD1的表達，細胞S期及G2/M期比例降低，G0/G1期比例升高，表明CPI203可阻滯腎癌ACHN細胞周期進展，影響腫瘤細胞的生長、生存。有研究發(fā)現(xiàn)CPI203可通過降低MYC、NOXA、AKT及ERK等眾多基因的表達從而抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞及淋巴瘤細胞的增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CPI203通過抑制腎癌ACHN細胞GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK基因的轉(zhuǎn)錄活性，減少其mRNA的表達量，同時降低這些基因的翻譯活性，進一步抑制GSK3β、CyclinD1、MYC、NOXA、AKT及ERK蛋白質(zhì)的生成及功能。

綜上所述，CPI203能夠殺傷腎癌ACHN細胞，抑制腎癌細胞生長周期進展，其潛在涉及的機制可能通過影響MYC、NOXA、AKT、ERK、GSK3β、CyclinD1等基因的表達有關(guān)。所以，CPI203是治療腎癌的潛在新藥物，為腎癌治療方案的選擇開辟出新道路。