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        石氏逐痰通絡(luò)補腎方對家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型組織學(xué)變化的影響

        2019-06-01 02:51:12吳軍豪沈祉培聞國偉上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院上海200002
        中成藥 2019年4期
        關(guān)鍵詞:方組膝骨性家兔

        吳軍豪, 沈祉培, 聞國偉, 陳 ?。ㄉ虾J悬S浦區(qū)中心醫(yī)院, 上海 200002)

        膝骨性關(guān)節(jié)炎又稱增生性膝關(guān)節(jié)炎、 膝骨關(guān)節(jié)病等,是骨科常見病之一, 由滑膜關(guān)節(jié)以伴有關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為特點的軟骨喪失所致[1], 臨床上以膝關(guān)節(jié)疼痛、 僵硬、活動受限等為特征, 可累及骨、 軟骨、 滑膜、 關(guān)節(jié)周圍支持結(jié)構(gòu)。 隨著人口老齡化加劇, 該疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢, 傳統(tǒng)上認為其機理是一個不可避免的漸發(fā)展退變性過程, 而膝關(guān)節(jié)滑膜炎性病變又促進骨關(guān)節(jié)炎病程進展。

        研究顯示[2], 中醫(yī)藥對改善局部血液循環(huán)、 保護關(guān)節(jié)軟骨、 防止關(guān)節(jié)軟骨退變、 調(diào)節(jié)生物細胞因子促進軟骨生長均有較顯著的作用。 石氏逐痰通絡(luò)補腎方由上海市黃浦區(qū)中心醫(yī)院石氏傷科根據(jù)中醫(yī)理論結(jié)合臨床經(jīng)驗配伍組方,臨床效果顯著, 故本實驗考察該方對家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)變化的影響。

        1 材料與方法

        1.1 研究設(shè)計 采用隨機平行對照方法, 在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院骨傷研究所進行實驗, 光鏡標(biāo)本送往上海中醫(yī)藥大學(xué)光鏡實驗室讀片。

        1.2 動物 雄性6 月齡新西蘭大白兔20 只, 體質(zhì)量(2.3±0.4) kg, 由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。

        1.3 分組 家兔喂養(yǎng)3 d, 稱定質(zhì)量后隨機分為正常組、模型組、 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組, 每組5 只。

        1.4 試藥 逐痰通絡(luò)補腎方(由生黃芪15 g、 牛蒡子9 g、僵蠶9 g、 制川草烏9 g、 土牛膝12 g、 威靈仙12 g、 仙靈脾12 g、 川斷12 g、 澤漆9 g、 白芷9 g、 木瓜12 g、 乳香3 g、 沒藥3 g、 自然銅15 g、 豨薟草12 g 等藥材組成); 扶他林緩釋片(瑞士諾華公司)。

        1.5 造模 氯胺酮按0.1 g/kg 體質(zhì)量的劑量肌注麻醉家兔后, Colombo 法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型[3]。

        1.6 干預(yù) 術(shù)后第5 周起至第8 周結(jié)束, 逐痰通絡(luò)補腎方組家兔每天給予0.09 g/kg 相應(yīng)藥物, 水煎濃縮后與飼料混合均勻, 制成定量顆粒飼料, 當(dāng)天吃完; 扶他林緩釋片組家兔每天給予0.09 g/kg 相應(yīng)藥物, 與飼料混合均勻, 制成定量顆粒飼料, 當(dāng)天吃完, 以上給藥量相當(dāng)于臨床等效劑量; 正常組、 模型組家兔未給藥。

        1.7 標(biāo)本采集 各組家兔于9 周后空氣栓塞處死, 打開右膝關(guān)節(jié)腔, 取下右膝關(guān)節(jié)標(biāo)本, 在右股骨外髁取關(guān)節(jié)軟骨。

        1.8 指標(biāo)檢測

        1.8.1 光鏡 標(biāo)本用10%福爾馬林固定, 10%EDTA 脫鈣,石蠟包埋、 切片, 厚度為5 μm, HE、 番紅固綠染色, 每張切片選取5 個視野, 光鏡下觀察組織學(xué)變化情況, 并參照Colombo 的關(guān)節(jié)軟骨病理積分標(biāo)準(zhǔn)[3]進行統(tǒng)計積分。

        1.8.2 透射電鏡 5% 戊二醛-4% 多聚甲醛固定, 10%EDTA 脫鈣, 漂洗, 1%鋨酸PBS 固定液固定, 乙醇逐級脫水, 環(huán)氧樹脂618 包埋, 切片, 枸櫞酸鉛電子染色, 透射電鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨細胞形態(tài)、 染色質(zhì)、 細胞器、 膠原密度、 排列等。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 10.0 軟件進行處理, 數(shù)據(jù)以±s) 表示, 組間比較采用非參數(shù)檢驗。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大體情況觀察 實驗過程中, 正常組家兔未見明顯異常; 第6 周, 模型組、 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔膝關(guān)節(jié)明顯腫脹, 部分有瘀紫, 關(guān)節(jié)活動度較差,不能正常行走; 第9 周, 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔大部分膝關(guān)節(jié)腫脹程度低于模型組, 關(guān)節(jié)活動度優(yōu)于模型組。 取出關(guān)節(jié)軟骨進行觀察, 發(fā)現(xiàn)正常組家兔關(guān)節(jié)軟骨呈明亮藍白色, 表面較軟無裂紋; 模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨發(fā)黃無光澤, 表面較硬, 關(guān)節(jié)表面有裂紋; 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔關(guān)節(jié)軟骨微黃無光澤, 表面較軟, 關(guān)節(jié)表面少量裂紋。

        2.2 光鏡觀察 圖1 顯示, 正常組家兔軟骨表面光滑, 軟骨細胞散在、 均勻排列; 模型組家兔軟骨層厚度明顯變薄,軟骨表面碎裂、 剝脫, 軟骨層內(nèi)排列稀疏、 不規(guī)則; 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔關(guān)節(jié)軟骨層厚度優(yōu)于模型組, 軟骨表面光滑, 而且前一組軟骨層厚度更優(yōu), 排列也更致密整齊。

        表1 顯示, 逐痰通絡(luò)補腎方組家兔關(guān)節(jié)軟骨病理變化總積分顯著低于模型組、 扶他林緩釋片組(P<0.05), 同時扶他林緩釋片組也顯著低于模型組(P<0.05); 逐痰通絡(luò)補腎方組家兔軟骨細胞病理改變(細胞成簇和細胞缺失)、 軟骨表層病理改變(表層缺損、 糜爛或潰瘍, 表面脆裂)、 軟骨深層病理改變(裂紋、 囊腫、 骨贅, 軟骨下骨暴露) 均顯著低于模型組、 扶他林緩釋片組組(P<0.05), 同時扶他林緩釋片組也顯著低于模型組(P<0.05)。

        圖1 各組家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型HE 染色(×100)

        表1 各組家兔關(guān)節(jié)軟骨病理變化積分比較, n=25)

        表1 各組家兔關(guān)節(jié)軟骨病理變化積分比較, n=25)

        注:與模型組比較,?P<0.05;與扶他林緩釋片組比較,#P<0.05

        軟骨細胞 0.85±1.00 6.55±0.95 3.15±1.08?# 4.05±0.82?軟骨表層 1.05±0.85 7.05±1.28 4.05±0.92?# 5.45±1.12?軟骨深層 1.15±0.82 10.50±0.72 5.40±1.22?# 8.05±1.05?總積分 3.05±1.52 24.10±1.40 12.60±1.55?# 17.55±1.40?

        圖2 顯示, 正常組家兔透明軟骨層呈深紅色, 軟骨細胞散在、 均勻排列; 模型組家兔透明軟骨厚度明顯變薄,而且其中部分因纖維化顯示綠色; 逐痰通絡(luò)補腎方組、 扶他林緩釋片組家兔透明軟骨厚度優(yōu)于模型組, 綠色纖維化組織少, 而且前一組透明軟骨厚度更優(yōu), 纖維化程度也更低。

        2.3 電鏡觀察 圖3 顯示, 正常組家兔軟骨細胞大小均勻, 細胞膜完整, 細胞結(jié)構(gòu)清晰, 染色質(zhì)分布均勻, 細胞周圍存在大量膠原纖維; 模型組家兔軟骨細胞大小不一,大量細胞膜被破壞, 細胞結(jié)構(gòu)不完整, 細胞核出現(xiàn)固縮,表明細胞可能發(fā)生壞死或者凋亡, 同時細胞周圍膠原纖維減少、 排列不整; 逐痰通絡(luò)補腎方組家兔核膜、 細胞結(jié)構(gòu)完整, 核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻, 細胞周圍膠原纖維排列整齊;扶他林緩釋片組家兔軟骨細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)有所修復(fù), 但不如逐痰通絡(luò)補腎方組明顯, 同時部分軟骨細胞核仁變性。

        3 討論

        最新流行病學(xué)調(diào)查[4]顯示, 60 歲以上人群中膝骨性關(guān)節(jié)炎患病率可達50%, 75 歲以上人群中則達80%, 軟骨退變與損壞與其發(fā)病密切相關(guān)[5]。 目前, 該疾病治療手段主要包括氨基硫酸鹽、 鎮(zhèn)痛劑、 非甾體類消炎藥(NSAID)、透明質(zhì)酸衍生物、 皮質(zhì)醇類關(guān)節(jié)腔內(nèi)給藥, 關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、關(guān)節(jié)置換等[6], 但各自都存在缺陷, 臨床上尚缺乏特效方法。

        圖2 各組家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型番紅固綠染色(×100)

        膝骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹” “痛痹” “寒痹” “鶴膝風(fēng)” 范疇, 《張氏醫(yī)通》 曰: “膝為筋之府, ……膝痛無有不因肝腎虛者, 虛則風(fēng)寒濕襲之”, 而且患者中以腎陽虛、瘀阻脈絡(luò)2 種癥候最多[7]。 近年來相關(guān)研究表明, 中醫(yī)藥可從關(guān)節(jié)軟骨細胞、 軟骨內(nèi)膠原纖維、 軟骨滑膜等多個方面改善關(guān)節(jié)軟骨組織的病理變化[8], 通過抑制細胞因子釋放來減輕軟骨炎癥反應(yīng)和損傷[9], 還能降低關(guān)節(jié)內(nèi)氧自由基含有量, 防止軟骨基質(zhì)降解[10]。

        圖3 各組家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型電鏡圖(×5 000)

        石氏認為, “痰夾瘀血礙氣而病” 是膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的主要原因, 一旦損傷必有氣機受阻, 氣機不暢必然影響到血的運行, 凝滯成瘀, 而血瘀又可使氣運失暢, 促成痰的形成[11], 同時還指出“……損傷氣血自屬氣脈閉塞,脘竅凝滯之類, 易于痰聚為患”, 故痰的凝聚能影響氣機正常運行, 氣機阻滯, 運行不暢, 則血運失暢, 從而促成血瘀的形成, 反之損傷血瘀也能使氣機運行失常, 氣結(jié)則痰生內(nèi)聚[11], 因此石氏治療該疾病時以“痰瘀相關(guān)” 理論為指導(dǎo), 通過逐痰通絡(luò)補腎方隨癥出入, 用于逐痰活血,通絡(luò)補腎, 改善循環(huán), 抑制炎癥介質(zhì), 保護及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。 石氏逐痰通絡(luò)補腎方中黃芪甘溫, 補氣兼能行滯通痹,助以川草烏宣通血脈、 散寒除濕; 牛蒡子辛寒滑利, 豁痰消腫, 白僵蠶消痰散結(jié)和氣血, 二藥合用宣滯破結(jié), 能化筋絡(luò)頑痰獨邪, 助以澤漆行水化濕消腫; 佐以乳香、 沒藥通氣活血, 白芷、 白蒺藜祛風(fēng)散寒, 木瓜、 桑枝、 土牛膝等諸藥祛風(fēng)濕、 舒筋絡(luò)、 利關(guān)節(jié)、 強筋骨, 全方圍繞“痰” “瘀” 二邪, 兼顧氣血, 體現(xiàn)了石氏傷科的經(jīng)典用藥思想——氣血行, 痰瘀祛, 而筋骨自健。

        本實驗對家兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型進行組織學(xué)變化觀察,發(fā)現(xiàn)石氏逐痰通絡(luò)補腎方具有修復(fù)損傷軟骨層與透明軟骨、阻止軟骨纖維化、 保持及恢復(fù)軟骨細胞結(jié)構(gòu)完整性等作用,而且效果優(yōu)于扶他林緩釋片, 可為該方相關(guān)治療提供確切依據(jù)。

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