郭菁菁， 趙英杰， 李 偉， 錢(qián)朝東， 丁志山

（1. 紹興市中心醫(yī)院藥劑科， 浙江 紹興 312030； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)， 浙江 杭州 310051）

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg 是我國(guó)特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物， 主要分布于長(zhǎng)江以南的江蘇、 浙江等地[1］， 作為民間常用中草藥， 擁有“藥王” “抗癌神草” 等美譽(yù)， 具有清熱解毒、 活血祛風(fēng)等功效， 有著抗腫瘤、 解熱、 抗炎、 保肝、 抗病毒、 免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[2］， 其中抗腫瘤活性的臨床應(yīng)用最廣泛。目前， 已有報(bào)道三葉青提取物具有較好的抗腫瘤活性[3］，但鮮有相關(guān)成分的文獻(xiàn)， 主要集中在塊根中的黃酮類化合物， 地上部分較少關(guān)注， 對(duì)其藥效組分的研究更是寥寥無(wú)幾。 前期課題組發(fā)現(xiàn)， 三葉青地上部分多糖可能為其藥效活性組分； 本實(shí)驗(yàn)建立小鼠乳腺癌荷瘤模型， 對(duì)該成分抗腫瘤藥效及其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討， 為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用相關(guān)資源提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 三葉青地上部分采自浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)受降鎮(zhèn)三葉青種植基地， 經(jīng)浙江省藥品檢驗(yàn)所專家鑒定為葡萄科三葉崖爬藤屬正宗紫藤三葉青品種 （浙食藥檢業(yè)《2015》 128 號(hào)）。

1.2 動(dòng)物 BALB／c 雄性小鼠（SPF 級(jí)）， 體質(zhì)量（22±2）g， 由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)， 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2013-0006。

1.3 細(xì)胞株 4T1 乳腺癌細(xì)胞株， 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院贈(zèng)予。

1.4 試劑 胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司， 批號(hào)20160720）； RPMI 1640 培養(yǎng)基（杭州諾森德生物技術(shù)有限公 司， 批 號(hào) ZI110516）； FITC anti-mouse CD4 （ 批 號(hào)100406）、 APC anti-mouse CD3 （批號(hào)100236）、 FITC Rat anti-Mouse CD4 （批號(hào)553046）、 PerCP anti-mouse CD8 （批號(hào)100734）、 PE Rat anti-Mouse FoxP3 （批號(hào)560408） （美國(guó)BD Biosciencens 公司）。

1.5 儀器 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；LDZ5-2 低速自動(dòng)平衡離心機(jī) （美國(guó)安瑪西亞公司）；Alpha1-2LD plus 真空冷凍干燥器（北京博勱行儀器有限公司）； Series II Water Jacket CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher公司）； Eclipse Ti-DH 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；BD Accuri 流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD 公司）。

2 方法

2.1 多糖制備 取一定量過(guò)60 目篩的藥材粉末， 稱定質(zhì)量， 用雙蒸水按物料比1 ∶15 在80 ℃下回流提取3 次， 每次30 min， 合并3 次濾液， 減壓濃縮到一定體積， 然后加入3 倍量95%乙醇， 充分混勻， 靜置12 h， 3 500 r／min 離心10 min， 得到沉淀， 同法反復(fù)水提醇沉2 次， 收集沉淀，再用無(wú)水乙醇反復(fù)洗脫2 次， 抽濾， 揮去乙醇， 真空冷凍干燥， 即得。

2.2 模型建立 4T1 細(xì)胞復(fù)蘇后， 在5% CO2、 37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中， 每2 ～3 d更換培養(yǎng)液并傳代， 收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1 細(xì)胞，無(wú)菌生理鹽水清洗后稀釋至2.5×106／mL， 于每只BALB／c小鼠右側(cè)倒數(shù)第二個(gè)乳房處注射0.2 mL， 48 h 后觀察該處有約2 mm×2 mm 的粉紅色小突起， 表明造模成功。

2.3 分組及給藥 將“2.2” 項(xiàng)下成模小鼠隨機(jī)分為模型組、 環(huán)磷酰胺組及多糖低、 中、 高劑量組， 每組10 只， 另設(shè)空白組小鼠10 只。 空白組、 模型組小鼠每天灌胃給予10 mL／kg蒸餾水； 環(huán)磷酰胺組小鼠隔天腹腔注射40 mg／kg環(huán)磷酰胺無(wú)菌生理鹽水； 多糖低、 中、 高劑量組分別給予50、 150、 250 mg／kg 藥液， 各組連續(xù)給藥28 d。 小鼠末次給藥后取血， 脫頸椎處死， 分離胸腺、 脾臟、 肺臟、 肝臟、瘤塊組織， 計(jì)算平均瘤質(zhì)量、 抑瘤率、 臟器指數(shù)， 觀察肺組織轉(zhuǎn)移灶。

2.4 外周血淋巴細(xì)胞分離 將小鼠血液收集于抗凝管中，加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液， 充分混懸后靜置10 min， 待紅細(xì)胞完全破碎后4 ℃、 1 500 r／min 離心3 min， 棄上清， 去除紅細(xì)胞。 此時(shí)沉淀應(yīng)為白色， 如有紅色， 則繼續(xù)加入裂解液， 重復(fù)上述離心操作， 然后用PBS 洗滌細(xì)胞1 次， 備用。

2.5 脾臟、 胸腺淋巴細(xì)胞分離 剖離小鼠脾臟、 胸腺組織， 剪刀剪成小塊， 加入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基配置酶試劑中， 搖床孵育1 h， 加入完全培養(yǎng)基終止消化。 然后， 注射器平端研磨組織， 200 目篩網(wǎng)過(guò)濾， 收集單細(xì)胞， 培養(yǎng)液稀釋至密度1×106／mL 的細(xì)胞懸液。 然后， 加入紅細(xì)胞裂解液， 破紅15 min， 離心， 取上清， 組織細(xì)胞用PBS 緩沖液清洗， 4 ℃、 1 400 r／min 離心5 min， 去上清， 備用。

2.6 外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg）檢測(cè) 將“2.4” 項(xiàng)下處理后外周血淋巴細(xì)胞用FACS 緩沖液清洗， 4 ℃、 1 400 r／min 離心5 min， 去上清。 然后， 加入FTIC-CD4、 APC-CD25 抗體各20 μL， 4 ℃下避光孵育15 min， FACS 清洗1 次， 加入破膜劑（Cytofix／Cytoperm），4 ℃下避光60 min， Perm buffer 清洗2 次。 再加入PE-Foxp3抗體， 4 ℃下避光孵育50 min， Perm buffer 清洗2 次，F(xiàn)ACS 重懸細(xì)胞， 上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 脾臟、 胸腺CD4＋、 CD8＋T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 將“2.5” 項(xiàng)下處理后的組織淋巴細(xì)胞加入APC-CD3、 FITCCD4、 PerCP／Cy5.5-CD8 抗 體， 4 ℃下 避 光 孵 育15 min，4 ℃、 1 000 r／min 離心5 min， 去上清。 然后， 加入500 μL PBS 重懸細(xì)胞， 上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理， 計(jì)量資料以s） 表示， 組間比較采用單因素方差分析； 計(jì)數(shù)資料以百分率表示， 組間比較采用卡方檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 多糖對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 表1 顯示， 與模型組比較， 給藥組小鼠瘤質(zhì)量、 瘤體積顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

表1 多糖對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響， n=10）

表1 多糖對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響， n=10）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

模型組 1.097±0.200 0.920±0.172 —環(huán)磷酰胺組 0.298±0.077△△ 0.215±0.081△△ 72.85多糖低劑量組 0.822±0.243△ 0.703±0.248△ 25.09多糖中劑量組 0.781±0.272△ 0.665±0.250△ 28.79多糖高劑量組 0.722±0.267△△ 0.595±0.197△△ 34.21

3.2 多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 表2 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠脾臟、 肝臟指數(shù)顯著升高， 胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）； 與模型組比較， 多糖組小鼠脾臟、 胸腺指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）， 而肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）； 與環(huán)磷酰胺組比較， 多糖組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）， 并且中、 高劑量組脾臟指數(shù)也顯著升高（P＜0.05）， 但各組肝臟指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

表2 多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響， n=10）

表2 多糖對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響， n=10）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 脾臟指數(shù)／% 胸腺指數(shù)／% 肝臟指數(shù)／%空白組 0.46±0.11 0.21±0.03 4.23±0.45模型組 2.77±0.81?? 0.17±0.03? 4.81±0.46??環(huán)磷酰胺組 1.82±0.45△△ 0.09±0.03△△ 4.92±0.29多糖低劑量組 2.15±0.54 0.15±0.05## 4.40±0.43△多糖中劑量組 2.52±0.60# 0.16±0.04## 4.41±0.34△多糖高劑量組 2.40±0.70# 0.17±0.05## 4.39±0.31△

3.3 多糖對(duì)小鼠遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移的影響 表3 顯示， 經(jīng)過(guò)28 d生長(zhǎng)后， 模型組小鼠腫瘤遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移明顯， 而給藥組均能明顯抑制其發(fā)生； 與模型組比較， 多糖組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

表3 多糖對(duì)小鼠遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移的影響（±s， n=10）

表3 多糖對(duì)小鼠遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移的影響（±s， n=10）

注：與模型組比較，△△P＜0.01

組別 （發(fā)生轉(zhuǎn)移荷瘤小鼠數(shù)／荷瘤小鼠總數(shù)）／只 肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)模型組 10／10 2.30±0.21環(huán)磷酰胺組 2／10 0.20±0.13△△多糖低劑量組 4／10 0.67±0.33△△多糖中劑量組 5／10 0.70±0.26△△多糖高劑量組 3／10 0.40±0.22△△

3.4 多糖對(duì)小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例的影響 表4、 圖1 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠其比例顯著降低（P＜0.01）。

表4 多糖對(duì)小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例的影響， n=6）

表4 多糖對(duì)小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例的影響， n=6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。 出于成本考慮，僅選擇6 只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

空白組 0.57±0.06模型組 1.50±0.36??環(huán)磷酰胺組 1.67±0.42多糖低劑量組 0.87±0.32多糖中劑量組 0.53±0.06△△多糖高劑量組 0.60±0.1△△

3.5 多糖對(duì)小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響 表5顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例有降低趨勢(shì)， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠兩者比例顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）。

圖1 多糖對(duì)小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例的影響

表5 多糖對(duì)小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響n=6）

表5 多糖對(duì)小鼠胸腺CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響n=6）

注：與模型組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01。 出于成本考慮，僅選擇6 只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

空白組 15.25±0.64 9.05±0.78 1.70±0.22模型組 11.65±0.64 7.05±1.06 1.66±0.16環(huán)磷酰胺組 11.10±0.71 8.50±0.14 1.31±0.06多糖低劑量組 14.30±0.42 10.45±2.62 1.41±0.31多糖中劑量組 19.90±2.83△△15.15±3.46△ 1.33±0.12多糖高劑量組 18.15±2.76△△14.10±5.09△ 1.34±0.29

3.6 多糖對(duì)小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響 表6、 圖2 顯示， 與空白組比較， 模型組小鼠脾臟CD4＋、CD8＋T 細(xì)胞比例顯著下降（P＜0.01）； 與模型組比較， 多糖中、 高劑量組小鼠前者比例顯著升高（P＜0.05）， 但后者比例無(wú)明顯變化（P＞0.05）， 同時(shí)CD4＋/CD8＋比例也顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 三葉青地上部分多糖可顯著抑制4T1 乳腺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)， 在250 mg／kg 時(shí)抑瘤率達(dá)到了34.21%。 環(huán)磷酰胺作為臨床常用的抗腫瘤藥物， 其最主要不良反應(yīng)是對(duì)機(jī)體的免疫抑制作用[4］， 而且對(duì)肝臟及骨髓也有一定損傷； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 多糖與環(huán)磷酰胺相比在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)還能顯著增加脾臟、 胸腺指數(shù)， 提示它對(duì)機(jī)體免疫器官具有保護(hù)作用。

表6 多糖對(duì)小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響s， n=6）

表6 多糖對(duì)小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響s， n=6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05

空白組 28.40±2.29 8.57±0.15 3.32±0.33模型組 13.35±0.21?? 3.55±0.07?? 3.76±0.02環(huán)磷酰胺組 12.05±0.35 3.45±0.49 3.52±0.40多糖低劑量組 13.95±1.06 2.95±0.50 4.77±0.44多糖中劑量組 18.00±1.56△ 3.40±0.57 5.33±0.43△多糖高劑量組 18.70±2.12△ 3.55±0.21 5.26±0.28△

圖2 多糖對(duì)小鼠脾臟CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例的影響

T 淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體重要的抗腫瘤細(xì)胞免疫系統(tǒng)[5-6］， 它源于骨髓干細(xì)胞， 在胸腺分化成熟， 活化后可分為輔助T 細(xì)胞（Th）、 細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）、 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）， 其中Th 均表達(dá)于CD4， 故也稱CD4＋T 細(xì)胞，根據(jù)其產(chǎn)生細(xì)胞因子及生物學(xué)功能的不同， 又分為T(mén)h1 和Th2 細(xì)胞， 前者主要分泌IFN-γ、 IL-2、 TNF 等， 介導(dǎo)細(xì)胞免疫， 輔助CTL 分化和增殖， 增強(qiáng)NK 細(xì)胞毒性， 從而起抗腫瘤作用， 而后者主要分泌IL-4、 IL-10、 IL-5、 IL-13等， 介導(dǎo)體液免疫， 輔助B 細(xì)胞， 從而抑制前者增殖[7］；CD8＋T 細(xì)胞屬于CTL， 具有細(xì)胞毒活性， 可直接殺傷腫瘤細(xì)胞， 在機(jī)體防御腫瘤免疫中起著重要作用， 但其本身不能特異性識(shí)別腫瘤抗原； 由于在CD8＋T 細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞和形成記憶細(xì)胞過(guò)程中， CD4＋T 細(xì)胞行使輔助功能， 故兩者在正常情況下保持動(dòng)態(tài)平衡， 以維持機(jī)體細(xì)胞正常免疫功能[8］， 而癌癥患者大多表現(xiàn)為免疫功能紊亂， T 淋巴細(xì)胞亞群比例發(fā)生改變， 如CD4＋T 淋巴細(xì)胞水平、 CD4＋／CD8＋比值下降等[9］。

CD4＋CD25＋Treg 細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg） 亞群，具有免疫抑制作用， 幫助腫瘤細(xì)胞參與免疫逃逸。 一方面，活化的CD4＋CD25＋Treg 細(xì)胞可通過(guò)抑制CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞的IL-2 基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)， 從而抑制T 細(xì)胞活化增殖[10］； 另一方面， 腫瘤組織通過(guò)CCL17、 CCL22 等趨化因子向腫瘤微環(huán)境招募該細(xì)胞。 另外， CD4＋CD25＋Treg 細(xì)胞可通過(guò)識(shí)別腫瘤抗原， 抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答， 使機(jī)體處于對(duì)腫瘤低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答狀態(tài)[11］， 同時(shí)它還能通過(guò)直接分泌或刺激DCs 分泌免疫抑制因子（IL-10、 TGF-β 等） 來(lái)達(dá)到免疫抑制作用。

結(jié)果顯示， 4T1 乳腺癌荷瘤小鼠外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 細(xì)胞比例明顯升高， 脾臟組織CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例明顯降低； 三葉青地上部分多糖能明顯升高CD4＋T細(xì)胞比例及胸腺組織CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例， 降低外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 比例， 提高脾臟組織CD4＋／CD8＋比例。 由此可知， 該成分可通過(guò)增加CD4＋、 CD8＋T 細(xì)胞比例， 抑制Treg 細(xì)胞數(shù)量與功能， 從而破壞由Treg 細(xì)胞引起的免疫耐受， 提高機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答， 發(fā)揮抗腫瘤活性。

綜上所述， 三葉青地上部分多糖可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答， 與該植物塊根有類似作用， 可為相關(guān)資源開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)， 也能為開(kāi)發(fā)新型中藥制劑提供理論基礎(chǔ)。 但目前僅對(duì)該成分與機(jī)體抗腫瘤免疫相關(guān)的T 淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行研究， 今后可結(jié)合參與腫瘤免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子以更深入地探討其抗腫瘤免疫調(diào)控機(jī)制， 同時(shí)三葉青地上、地下部分多糖是否屬于同一物質(zhì)也有待進(jìn)一步考察。