李 潔， 楊 駿， 何 琳， 陸蕙蘭

（上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科， 上海 200020）

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， 應(yīng)用滋陰降火中成藥治療兒童性早熟的療效顯著， 并通過(guò)動(dòng)物模型闡釋其機(jī)理[1-3］。 知柏龍膽片（SYZ-ZF-087-2005） 源于上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科經(jīng)驗(yàn)方， 為補(bǔ)陰名方大補(bǔ)陰丸化裁而得， 是由黃柏、知母、 熟地黃、 醋龜甲、 龍膽5 味藥材組成的中藥復(fù)方制劑， 具有滋陰降火之功效， 臨床用于治療生長(zhǎng)發(fā)育加速（性早熟）[4］。 但目前該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單， 而中藥方劑由多味藥材組成[5］， 常以“君臣佐使” 規(guī)律相互制約和協(xié)調(diào)， 強(qiáng)調(diào)從整體上發(fā)揮作用， 僅靠單一成分難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。 因此， 在已有研究基礎(chǔ)上， 本實(shí)驗(yàn)增加知柏龍膽片中黃柏、 龍膽、 龜甲、 知母等藥材的定性定量測(cè)定， 以保證臨床用藥安全有效[6-7］、 含有量均一[8］， 并完善其質(zhì)量控制體系。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）， 配置VWD 檢測(cè)器； Phenomenex C18、 Shiseido C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； AUW220D 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； XP205 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Scanner3＆Linomat5 薄層掃描儀（瑞士卡瑪公司）； HWS26 恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； 202-1A 真空干燥箱（上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠）； SK7210HP 超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）； DFY-400 粉碎機(jī) （上海精廣機(jī)械設(shè)備有限公司）； TC-15 電熱套（海寧新華醫(yī)療器械廠）。

1.2 飲片 黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)Phellodendron chinense Schneid. 干燥樹(shù)皮的炮制品 （產(chǎn)地四川， 批號(hào)16041302）， 知 母 為 百 合 科 植 物 知 母 Anemarrhena asphodeloides Bge. 干燥根莖的炮制品 （產(chǎn)地河北， 批號(hào)16120803）， 熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 干燥塊根的炮制品（產(chǎn)地河南， 批號(hào)16051702），醋龜甲為龜科動(dòng)物烏龜Chinemys reevesii （Gray） 背甲及腹甲的炮制品（產(chǎn)地廣東， 批號(hào)17011702）， 龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bunge. 干燥根和根莖的炮制品（產(chǎn)地遼寧， 批號(hào)17010303）。 以上飲片均購(gòu)自上海華濟(jì)藥業(yè)有限公司， 經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)專(zhuān)家鑒定為正品。

1.3 試藥 芒果苷（批號(hào)111607-200402）、 知母皂苷BⅡ（批 號(hào) 111839-201102）、 鹽 酸 小 檗 堿 （批 號(hào) 110713-201613）、 賴(lài)氨酸（批號(hào)L103479）、 亮氨酸（批號(hào)140687-201102）、 纈氨酸（批號(hào)140681-200401）、 龍膽苦苷（批號(hào)110770-201515） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。 知柏龍膽片（批號(hào)170301、 170601、 170801）， 由上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院提供。 乙腈、 甲醇為色譜純（德國(guó)Merck 公司）； 其余試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別

2.1.1 醋龜甲 取本品適量， 研碎至細(xì)粉， 稱(chēng)取1 g， 加10 mL 水加熱至沸， 放冷， 離心（10 000 r／min） 10 min，取上清液， 作為供試品溶液； 取處方中除醋龜甲外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺醋龜甲陰性供試品， 同法制成相應(yīng)溶液； 取賴(lài)氨酸、 亮氨酸、 纈氨酸對(duì)照品， 加水制成每1 mL 分別含1、 1、 0.5 mg 上述成分的溶液， 作為對(duì)照品溶液。 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部薄層色譜法（通則0502）， 吸取陰性供試品溶液5 μL、 3 種對(duì)照品溶液各5 μL、 供試品溶液10、 2 μL， 點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開(kāi)劑， 展開(kāi)， 取出，晾干， 噴以茚三酮試液， 105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖可知， 供試品色譜在對(duì)照品（點(diǎn)樣量10 μL） 相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)[9-10］， 陰性無(wú)干擾， 同時(shí)在2 μL 點(diǎn)樣量下斑點(diǎn)較淡， 故選擇點(diǎn)樣量為10 μL。

圖1 醋龜甲TLC 色譜圖

2.1.2 知母 取本品適量， 研碎至細(xì)粉， 稱(chēng)取1 g， 加10 mL稀乙醇超聲（53 kHz、 20 ℃） 20 min， 放冷， 離心（10 000 r／min） 10 min， 取上清液， 作為供試品溶液； 取處方中除知母外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺知母陰性供試品， 同法制成相應(yīng)溶液； 取芒果苷對(duì)照品， 加稀乙醇制成每1 mL 含1.0 mg 該成分的溶液， 作為對(duì)照品溶液。按照2015 年版 《中國(guó)藥典》 四部薄層色譜法 （通則0502）， 吸取對(duì)照品溶液5 μL、 供試品溶液10 μL、 陰性供試品溶液5 μL， 點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上， 以乙醇-水（1 ∶1） 為 展 開(kāi) 劑， 展 開(kāi)， 取 出， 晾 干， 置 于 紫 外 光 燈（365 nm） 下檢視， 結(jié)果見(jiàn)圖2。 由圖可知， 供試品色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)， 陰性無(wú)干擾。

圖2 知母TLC 色譜圖

2.2 HPLC 含有量測(cè)定

2.2.1 鹽酸小檗堿

2.2.1.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸（50 ∶50） （每100 mL 加0.3 g 十二烷基磺酸鈉）； 檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm； 柱溫30 ℃。 理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算， 應(yīng)不低于4 000。

2.2.1.2 供試品溶液制備 取本品10 片， 研碎至細(xì)粉，精密稱(chēng)取0.5 g， 置于錐形瓶中， 精密加入75% 甲醇100 mL， 稱(chēng)定質(zhì)量， 回流45 min， 冷卻， 75% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3 陰性供試品溶液制備 根據(jù)處方比例取除黃柏外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺黃柏供試品， 按“2.2.1.1” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.2.1.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量， 加甲醇制成每1 mL 含21.52 μg 該成分的溶液， 即得。

2.2.1.5 專(zhuān)屬性考察 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇2015 年版《中國(guó)藥典》 一部黃柏項(xiàng)下的265 nm， 對(duì)照品、 供試品、 陰性供試品溶液在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 發(fā)現(xiàn)陰性無(wú)干擾， 色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖

2.2.1.6線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量， 流動(dòng)相制成1.076 mg／mL 貯備液， 稀釋10 倍， 精密吸取適量， 甲醇制成2.152、 4.304、 10.76、 21.52、 53.80、107.6、 215.2 μg／mL 對(duì)照品溶液， 在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=42.607X＋10.231 （r=1）， 在2.152～215.2 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（21.52 μg／mL）10 μL， 在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為0.99%， 表明儀器精密度良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)170301） 適量， 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 室溫下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.10%， 表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)170301） 6 份， 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得鹽酸小檗堿含有量RSD 為1.93%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取9 份鹽酸小檗堿含有量已知（2.91 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入對(duì)照品溶液（2.51 mg／mL） 0.15、 0.3、 0.45 mL， 各3 份， 分別相當(dāng)于取樣量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.2 龍膽苦苷

2.2.2.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動(dòng)相甲醇-水（25 ∶75）； 檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm； 柱溫30 ℃。 理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算， 應(yīng)不低于3 000。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取本品10 片， 研碎至細(xì)粉，精密稱(chēng)取0.5 g， 置于錐形瓶中， 精密加入50%乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量， 超聲（53 kHz、 20 ℃） 45 min， 冷卻， 50% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.2.2.3 陰性供試品溶液制備 根據(jù)處方比例取除龍膽外其余飲片， 按照生產(chǎn)工藝制備缺龍膽供試品， 按“2.2.2.2” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.2.2.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品適量， 加甲醇制成每1 mL 含50.4 μg 該成分的溶液， 即得。

2.2.2.5 專(zhuān)屬性考察 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇2015 年版《中國(guó)藥典》 一部龍膽項(xiàng)下的270 nm， 對(duì)照品、 供試品、 陰性供試品溶液在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 發(fā)現(xiàn)陰性無(wú)干擾， 色譜圖見(jiàn)圖4。

2.2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品適量，甲醇制成0.100 8 mg／mL 貯備液， 精密吸取適量， 甲醇制成5.040、 10.08、 25.20、 50.40、 100.8、 201.6 μg／mL 對(duì)照品溶液， 在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=26.781X-0.622 8（r=1）， 在5.040～201.6 μg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（50.4 μg／mL）， 在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定6 次， 測(cè)得龍膽苦苷峰面積RSD 為0.37%， 表明儀器精密度良好。

圖4 龍膽苦苷HPLC 色譜圖

2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)170301） 適量， 按“2.2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 室溫下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得龍膽苦苷峰面積RSD 為0.30%， 表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)170301） 6 份， 按“2.2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得龍膽苦苷含有量RSD 為0.96%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取9 份龍膽苦苷含有量已知（1.96 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入對(duì)照品溶液（1.74 mg／mL） 0.15、 0.25、 0.4 mL， 各3 份， 分別相當(dāng)于取樣量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.3 樣品含有量測(cè)定 取本品3 批 （批號(hào)170301、170601、 170801）， 按“2.2.1.2” 和“2.2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.2.1.1” 和“2.2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表3。 根據(jù)3 批平均含有量， 取其80%作為下限， 結(jié)合片劑質(zhì)量0.3 g／片， 擬制定知柏龍膽片中鹽酸小檗堿、 龍膽苦苷含有量分別不低于0.72、 0.45 mg／片。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用硅膠G 薄層板作為固定相， 以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 為展開(kāi)劑， 茚三酮試液為顯色劑， 加熱顯色， 制訂了龜甲TLC 定性鑒別項(xiàng)。 在制訂知母TLC 定性鑒別項(xiàng)時(shí)， 發(fā)現(xiàn)以知母皂苷BⅡ?yàn)閷?duì)照品無(wú)法消除陰性供試品干擾， 最終確立以芒果苷為對(duì)照品。

本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定鹽酸小檗堿含有量時(shí)， 考察了乙腈-磷酸二氫鉀（50 ∶50） （每100 mL 加0.2、 0.3 g 十二烷基磺酸鈉和0.2 g 磷酸二氫鉀） 流動(dòng)相[11］、 柱溫、 檢測(cè)波長(zhǎng)、 色譜柱； 在制備供試品溶液時(shí)， 考察了提取方法（回流、 超聲）、 提取溶劑（25%甲醇、 50%甲醇、 75%甲醇、 25%乙醇、 50%乙醇、 75% 乙醇）、 提取時(shí)間（15、 30、 45、 60、90 min）， 最 終 確 定 “2.2.1.1” 項(xiàng) 下 色 譜 條 件 和“2.2.1.2” 項(xiàng)下供試品溶液制備方法。 在測(cè)定龍膽苦苷含有量時(shí)， 流動(dòng)相考察了乙腈-0.4% 磷酸（12 ∶88）[12］、 乙腈-水（12 ∶88）[13］， 發(fā)現(xiàn)分離度不好， 而“2.2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件[14］可獲得良好的分離效果， 而且基線平穩(wěn)， 峰形對(duì)稱(chēng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立TLC、 HPLC 法建立知柏龍膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確， 重復(fù)性好， 可為該制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。