幺寶金， 果淑鳳， 袁勁松， 劉 佳， 趙大慶?

（1. 長春中醫(yī)藥大學(xué)， 吉林省人參科學(xué)研究院， 吉林 長春 130117； 2. 北京世紀(jì)圣科科技發(fā)展有限公司，北京 100010； 3. 長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 長春 130117）

圣科健骨膠囊是由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國疾病預(yù)防控制中心專家結(jié)合國際上防治骨質(zhì)疏松癥的最新科研成果研制而成的保健產(chǎn)品， 作為健骨類產(chǎn)品在市場上銷售多年， 取得了良好療效， 該制劑從骨代謝本質(zhì)入手， 遵循“補(bǔ)骨、 修骨和養(yǎng)骨”三位一體理論， 將國際公認(rèn)的高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養(yǎng)素按照一定比例復(fù)合而成， 通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌可有效促進(jìn)骨基質(zhì)生成， 達(dá)到補(bǔ)充骨量、 修復(fù)損傷骨組織、 養(yǎng)護(hù)骨骼的功效。 本實驗采用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)定性定量（iTRAQ） 分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法， 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進(jìn)行差異表達(dá)分析， 以期揭示其健骨功效的內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料

清潔級雌性SD 大鼠40 只， 體質(zhì)量（220±20） g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司， 實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （吉） -2016-0003。 圣科健骨膠囊由北京世紀(jì)圣科科技發(fā)展有限公司提供， 主要由高效健骨因子與納米鈣、 活化維生素D3、 微量元素等多種骨營養(yǎng)素按照一定比例復(fù)合而成。 ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒購于美國Bio-Rad公司； iTRAQ 蛋白標(biāo)記試劑盒購于美國AB Sciex公司。 二硫蘇糖醇、 碘乙酰胺、 三乙基碳酸氫銨、胰蛋白酶等為分析純， 購于美國Sigma 公司。 乙腈、 甲醇為色譜純， 購于美國Thermo 公司； 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 蛋白提取制備

2.1.1 給藥及血清采集 將大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組， 每組20 只， 給藥組給予1 g／kg 圣科健骨膠囊生理鹽水混懸液， 空白組給予等體積生理鹽水， 每天灌胃給藥1 次， 連續(xù)3 周。 末次灌胃給藥次日， 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉， 頸總動脈收集血液， 4 ℃靜置2 h， 2 000×g 離心5 min， 收集上清液， 10 000×g 離心10 min， 收集血清， 血清組分保存于-80 ℃下。

2.1.2 蛋白富集及酶解 將空白組、 給藥組血清分別合并， 經(jīng)ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒去除免疫球蛋白和白蛋白等高豐度蛋白， 采用Bradford 法測定蛋白濃度。 取2 組血清蛋白各100 μg， 加入10 mmol／L 二硫蘇糖醇， 37 ℃下還原處理1 h 后加入20 mmol／L 碘乙酰胺烷化處理45 min， 再加入5 μg 胰蛋白酶， 37 ℃下酶解4 h后再補(bǔ)加5 μg 繼續(xù)酶解8 h， 凍干。

2.1.3 蛋白酶解、 標(biāo)記和純化 將酶解蛋白凍干粉溶于0.5 mol／L 三乙基碳酸氫銨中， iTRAQ 蛋白標(biāo)記試劑盒進(jìn)行酶解蛋白標(biāo)記， 島津LC-20AB 液相系統(tǒng)進(jìn)行肽段分離。 分析采用Ultremex SCX 層析柱（美國Phenomenex 公司）； 洗脫液Buffer A，pH 2.7， 含25 mmol／L 磷酸二氫鉀和25% 乙腈；Buffer B， pH 2.7， 含25 mmol／L 磷 酸 二 氫 鉀、1 mol／L氯化鉀和25% 乙腈， 洗脫條件為Buffer A 10 min， 5% ～35% Buffer B 11 min， 35% ～80%Buffer B 1 min； 吸收波長214 nm。 收集不同組分，經(jīng)Strata X 層析柱除鹽后凍干。

2.1.4 液質(zhì)鑒定及生物信息學(xué)分析 通過超高液相色譜nanoACQUITY 聯(lián)合質(zhì)譜TripleTOF 5600 技術(shù)進(jìn)行肽段鑒定， 采用Symmetry C18、 BEH130 C18色譜柱（美國Waters 公司）； 流動相A 液為水-乙腈-甲酸 （98 ∶ 2 ∶ 0.1）， B 液 為 水-乙 腈-甲 酸（2 ∶98 ∶0.1）； 洗脫條件為A 液15 min， 5%B 液1 min， 5% ～35% B 液40 min， 35% ～80% B 液5 min， 80%B 液5 min； 質(zhì)譜參數(shù)反射掃描， 分辨率3.0×104以上； 脈沖頻率11 kHz； 碰撞能量（35±5 eV）。 然后， 通過ProteinPilot 5.0 軟件（美國AB Sciex 公司） 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 蛋白鑒定錯誤率FDR≤1%， 當(dāng)2 組樣品蛋白質(zhì)豐度差異倍數(shù)≥1.5 倍或≤0.67 倍， 且P＜0.05 時可認(rèn)定為差異蛋白， 其功能富集采用AmiGO 進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 血清差異蛋白功能富集分析 共鑒定出237 種表達(dá)蛋白， 與空白組比較， 給藥組顯著上調(diào)的差異蛋白（差異倍數(shù)≥1.5 倍， P＜0.05） 有130 種， 顯著下調(diào)的（差異倍數(shù)≤0.67 倍， P ＜0.05） 有107種。 針對這些差異蛋白， 首先進(jìn)行功能富集分析，包括細(xì)胞組分、 分子功能、 生物進(jìn)程3 種功能分類。

在細(xì)胞組分功能分類中， 差異蛋白主要歸類為細(xì)胞外區(qū)域、 皮質(zhì)肌動蛋白細(xì)胞骨架、 蛋白酶體核心復(fù)合物、 肌動蛋白絲、 肌動球蛋白等， 具體見表1。

表1 血清差異蛋白細(xì)胞組分富集分析（P＜0.05）Tab.1 Cellular component enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

在分子功能分類中， 差異蛋白主要歸類為肽酶調(diào)節(jié)劑活性、 抗原結(jié)合、 肽酶抑制劑活性、 酶抑制劑活性、 過氧化物酶活性、 絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性等， 具體見表2。

在生物進(jìn)程分類中， 差異蛋白主要歸類為蛋白水解調(diào)節(jié)、 外源刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、 壓力反應(yīng)調(diào)節(jié)、 大分子復(fù)合物亞基組織、 肽鏈內(nèi)切酶活性調(diào)節(jié)、 肽酶活性調(diào)節(jié)等， 具體見表3。

3.2 含藥血清健骨功效分子機(jī)制研究 基于“3.1” 項下結(jié)果， 對給藥后大鼠血清中顯著上調(diào)（差異倍數(shù)≥1.5 倍， P＜0.05） 的差異蛋白作進(jìn)一步分析， 結(jié)果共篩選出14 種調(diào)控骨形成及骨質(zhì)密度的功能蛋白， 具體見表4， 主要包括Greb1 蛋白（Greb1）、 絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶D3 （Prkd3）、張力蛋白 （Tns4）、 絲氨酸蛋白酶抑制劑A3M（Serpina3m）、 微管相關(guān)蛋白1 A （Map1a） 等。

表2 血清差異蛋白分子功能富集分析（P＜0.05）Tab.2 Molecular function enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

3.3 含藥血清抗炎功效分子機(jī)制研究 基于“3.1” 項下結(jié)果， 對給藥后大鼠血清中顯著下調(diào)（差異倍數(shù)≤0.67 倍， P＜0.05） 的差異蛋白作進(jìn)一步分析， 結(jié)果共篩選出12 種參與炎性反應(yīng)的功能蛋白， 具體見表5， 主要包括鋅指同源蛋白2（Zfhx2）、 NF-kappa-B 抑制劑zeta （Nfkbiz）、 激肽原-1 （Kng1）、 絲氨酸蛋白酶hepsin （Hpn） 等。

4 討論

本實驗采用iTRAQ 分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法， 對圣科健骨膠囊給藥后大鼠血清蛋白組進(jìn)行系統(tǒng)分析， 共鑒定出237 種差異蛋白。 功能富集分析結(jié)果表明， 這些差異蛋白主要為細(xì)胞外基質(zhì)、 細(xì)胞骨架蛋白、 蛋白酶體復(fù)合物等， 主要參與酶調(diào)節(jié)、 抗原結(jié)合、 蛋白水解調(diào)節(jié)、 外源刺激反應(yīng)調(diào)節(jié)、 壓力反應(yīng)調(diào)節(jié)、 大分子復(fù)合物亞基組織、 肽酶活性調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程。

表3 血清差異蛋白生物進(jìn)程富集分析（P＜0.05）Tab.3 Biological process enrichment analysis of serum differential proteins （P＜0.05）

表4 含藥血清健骨功效差異蛋白分析Tab.4 Differential protein analysis of medicated serum for bone-invigorating effect

表5 含藥血清抗炎功效差異蛋白分析Tab.5 Differential protein analysis of medicated serum for anti-inflammatory effect

與空白組比較， 圣科健骨膠囊組顯著上調(diào)的差異蛋白主要包括Greb1、 Prkd3、 Tns4、 Serpina3m等調(diào)控骨形成及骨質(zhì)密度的功能蛋白。 其中，Greb1 作為雌激素調(diào)節(jié)通路的重要分子， 在成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞中表達(dá)量顯著上調(diào)， 其遺傳變異與骨密度變化導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[1-2］； Prkd3屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族成員， 是成骨細(xì)胞分化和礦化結(jié)節(jié)形成的重要調(diào)控因子[3］； Tns4屬于支架蛋白家族成員， 是細(xì)胞生長和遷移的重要調(diào)控因子， 主要通過觸發(fā)整聯(lián)蛋白與肌動蛋白細(xì)胞骨 架 的 解 偶 聯(lián) 來 實 現(xiàn)[4］； Serpina3m、 Serpina3l、Serpina3k 同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpina3 亞型， 可通過抑制局部絲氨酸蛋白酶濃度進(jìn)而調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的動態(tài)平衡[5］； Map1a 屬于微管相關(guān)蛋白家族成員， 可通過調(diào)節(jié)微管組裝、 微管結(jié)構(gòu)及功能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[6］； Prdx2 主要在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)， 可有效阻止骨髓老化[7］； Prl是一種蛋白質(zhì)激素， 可減少破骨細(xì)胞形成和骨質(zhì)流失， 促進(jìn)骨形成[8］； Gpx1 是一種抗氧化酶， 主要調(diào)控細(xì)胞防御氧化損傷， 從而防止骨質(zhì)疏松癥等與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生[9］； Epb41 最初被認(rèn)為是紅細(xì)胞膜分子， 主要負(fù)責(zé)維護(hù)細(xì)胞的完整性及膜骨架和跨膜蛋白之間的相互作用， 最近研究表明， 該基因缺失小鼠腸鈣吸收功能受損， 進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)所致的骨鈣缺失[10］； 另外， 顯著上調(diào)的差異表達(dá)蛋白還包括具有抗炎、 抗感染、 排毒功效的功能蛋白， 如Ngp、 Cfp、 Ces1c 等[11-13］。 由此表明， 圣科健骨膠囊的健骨功效主要是通過上調(diào)以上參與調(diào)控骨密度和骨形成過程的功能蛋白來實現(xiàn)的。

與空白組比較， 圣科健骨膠囊組顯著下調(diào)的差異 蛋 白 主 要 包 括 Zfhx2、 Nfkbiz、 Kng1、 Hpn、Prkcsh 等參與骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)的相關(guān)因子。 其中， Kng1 是一種高分子量激肽原，該基因缺失小鼠可有效拮抗PG-PS 所致骨關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)及軟骨損傷[14］； Hpn 是一種絲氨酸蛋白酶， 大量研究表明蛋白水解級聯(lián)中的絲氨酸蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)如骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織的病理性損傷[15］； Pcsk9 是一種促炎因子， 其基因缺失小鼠可有效降低炎性反應(yīng)相關(guān)因子表達(dá)[16］； Cd5l、 Fcn2、Xpnpep2、 Ganab 等在骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液或關(guān)節(jié)軟骨中表達(dá)量顯著上調(diào)[17-20］；DKK3 缺失可抑制NF-κB 信號通路， 進(jìn)而降低炎性反應(yīng)癥狀[21］； Nfkbiz 為非典型IκB 蛋白家族成員，也為各種炎癥刺激誘導(dǎo)下NF-κB 的主要反應(yīng)因子，既是促炎因子， 又是抗炎基因產(chǎn)物活性的調(diào)控因子[22］； Zfhx2、 Prkcsh、 Napsa 等在炎性反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[23］。 由此表明， 圣科健骨膠囊可通過抑制相關(guān)炎性因子表達(dá)來對骨關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實現(xiàn)防治作用。