張湘奇， 陳君君， 楊 姣，， 石美智， 祁美娟， 肖 霄， 韓永龍，?

（1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院藥劑科， 上海 200233； 2. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院藥劑科， 上海 201306； 3. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院， 上海 201306）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率第二、 致死率第一的惡性腫瘤[1］， 目前臨床治療常為手術(shù)加化療， 而國內(nèi)將抗腫瘤中藥注射液與化療藥物聯(lián)用[2-4］以協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤效果， 提高機(jī)體免疫功能。 中藥可作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展多個(gè)環(huán)節(jié)， 具有安全性高、 價(jià)格低廉、 不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)， 中藥注射劑治療惡性腫瘤時(shí)， 無論是在減輕臨床癥狀、 防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、 延長生存期、 提高生存質(zhì)量， 還是在與放化療配合、 增效減毒等方面都呈現(xiàn)出較好的療效[5］， 但其種類繁多， 成分復(fù)雜， 抗癌機(jī)制不明，從而限制了合理應(yīng)用。

轉(zhuǎn)錄激活因子3 （ATF3） 是轉(zhuǎn)錄因子ATF／CERB 家族成員之一， 在腫瘤細(xì)胞增殖、 凋亡、 轉(zhuǎn)移方面起著重要作用[6］， 近年來有研究者提出可將其作為抗腫瘤藥物新靶點(diǎn)[7］。 本實(shí)驗(yàn)選取臨床常用的6 種抗腫瘤中藥注射液（消癌平注射液、艾迪注射液、 華蟾素注射液、 復(fù)方苦參注射液、 斑蝥酸鈉維生素B6注射液、 參芪扶正注射液）， 評(píng)價(jià)其對(duì)2 種卵巢癌細(xì)胞A2780、 SK-OV-3 增殖的抑制作用及細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的影響， 從而篩選通過作用于ATF3 來影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的中藥注射劑， 對(duì)相關(guān)抗癌機(jī)制研究有重要意義。

1材料

1.1 試藥 消癌平注射液（南京圣和藥業(yè)有限公司， 每支20 mL， 每1 mL 含1 g 通關(guān)藤， 批號(hào)201709111）； 艾迪注射液（貴州益佰制藥股份有限公司， 每支10 mL， 批號(hào)20160833）； 華蟾素注射液（安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司， 每支5 mL， 每1 mL 含0.5 g 干蟾皮， 批號(hào)61206-1）；復(fù)方苦參注射液（山西振東制藥股份有限公司，每支5 mL， 每1 mL 含2 g 苦參， 批號(hào)20170304）；斑蝥酸鈉維生素B6注射液（貴州柏強(qiáng)制藥有限公司， 每支10 mL， 每1 mL 含0.1 mg 斑蝥酸鈉， 批號(hào)2016080602）； 參芪扶正注射液（麗珠集團(tuán)利民制藥廠， 每瓶250 mL， 批號(hào)20170511）。 胎牛血清（批 號(hào) 1932562）、 0.25% 胰 蛋 白 酶 （ 批 號(hào)1951049）、 青霉素、 鏈霉素溶液 （批號(hào)15140-122） （美國Gibco 公司）； DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)AD17628284）、 McCOY’ 5A 培 養(yǎng) 基 （批 號(hào)AC13430279） （美國HyClone 公司）； 噻唑藍(lán)MTT（批號(hào)303H0528） （北京索萊寶科技有限公司）；曲格列酮（美國Cayman 公司， CAS 號(hào)97322-87-7，貨號(hào)71750）； RNA isolater Total RNA Extraction Reagent （貨號(hào)R401-01， 批號(hào)7E141K7）、 HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR （＋gDNA wiper） （貨號(hào)R223-01， 批 號(hào)7E140L7）、 ChamQ SYBR qPCR Master Mix （High ROX Premixed） （貨號(hào)Q341-02，批號(hào)7E170L7） （南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780， 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院； 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3， 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.3 儀器 生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司， 型號(hào)Class II BSC）； 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Panasonic 公司， 型號(hào)MCO-18AIC）； 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司， 型號(hào)ME203）； 臺(tái)式低溫離心機(jī) （美國Beckman 公司， 型號(hào)Microfuge 20R）； 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Molecular Devices 公司， 型號(hào)Spectra Max i3x）； 定量PCR 儀（美國ABI 公司， 型號(hào)Pro Flex）； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Roche 公司， 型號(hào)Light Cycler 480II）。

2 方法

2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) A2780 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、 1%青霉素-鏈霉素溶液（兩者終濃度分別為100 U／mL、 100 μg／mL） 的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、 CO2飽和濕度5%，每2～3 d 傳代1 次， 培養(yǎng)2 ～3 代后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 SK-OV-3 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、 1%青霉素-鏈霉素溶液的McCOY’5A 完全培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、 CO2飽和濕度5%， 每3～5 d 傳代1 次， 培養(yǎng)2 ～3 代后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 中藥注射液對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的作用 采用MTT 法。 調(diào)整細(xì)胞懸液密度至5×104／mL， 接種于96 孔培養(yǎng)板中， 每孔100 μL， 即5×103細(xì)胞／孔，空白組加入相應(yīng)量無細(xì)胞培養(yǎng)基， 細(xì)胞貼壁后根據(jù)藥物濃度梯度加入含藥培養(yǎng)基， 參考文獻(xiàn)[8-12］和預(yù)實(shí)驗(yàn)， 分別確定為消癌平注射液10、 20、40 μL／mL， 艾迪注射液10、 20、 40 μL／mL， 華蟾素注射液5、 10、 20 μL／mL， 復(fù)方苦參注射液1、5、 10 μL／mL， 斑蝥酸鈉維生素B6注射液50、100、 200 μL／mL， 參 芪 扶 正 注 射 液 25、 50、100 μL／mL， 而對(duì)照組、 空白組加入不含藥培養(yǎng)基， 每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔， 37 ℃、 5%CO2下培養(yǎng)24 h。無菌PBS 緩沖液溶解MTT 粉末， 制成5 mg／mL 溶液， 每孔加入10 μL MTT 溶液繼續(xù)孵育4 h， 棄去上清， 加入150 μL DMSO 振蕩溶解紫色晶體10 min， 酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長下吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖率， 公式為增殖率= [（實(shí)驗(yàn)組A-空白組A） /（對(duì)照組A-空白組A） ］ ×100%， 平行3 次， 取平均值。

2.3 中藥注射液對(duì)卵巢癌細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的影響 采用RT-PCR 法。 細(xì)胞接種于6 孔板中， 每孔5×105個(gè)細(xì)胞， 細(xì)胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基處理12 h， 用含40 μmol／L 陽性誘導(dǎo)劑曲格列酮[13］的完全培養(yǎng)基配制終濃度分別為消癌平注射液10、 20、 40 μL／mL， 艾 迪 注 射 液 10、 20、40 μL／mL， 華蟾素注射液5、 10、 20 μL／mL， 復(fù)方苦參注射液1、 5、 10 μL／mL， 斑蝥酸鈉維生素B6注射液50、 100、 200 μL／mL， 參芪扶正注射液25、 50、 100 μL／mL 的藥液， 而對(duì)照組只加入無藥培養(yǎng)基， 陽性誘導(dǎo)組只加入含40 μmol／L 曲格列酮的完全培養(yǎng)基， 各濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔， 每孔完全培養(yǎng)基加2 mL 藥物。 作用24 h 后， Trizol 法提取總RNA， 酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 純度及濃度， 按上樣1 000 ng計(jì)算各樣品上樣量， 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL 上樣體系加入PCR 小管中， 置于PCR 擴(kuò)增儀上， 50 ℃下運(yùn)行15 min 合成cDNA，85 ℃下運(yùn)行5 s 終止反應(yīng)， 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板， 按PCR 擴(kuò)增說明書加入相應(yīng)量擴(kuò)增溶液及引物， 20 μL 上樣體系中含25 ng模板DNA、 10 μmol／L 引物、 10 μL RT-PCR Master Mix， 96 孔檢測(cè)板離心后， 放入熒光定量PCR 儀上， PCR 反應(yīng)條件為95 ℃下酶激活30 s， 95 ℃下變性10 s， 60 ℃下退火延伸30 s， 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)后降溫得融解曲線， 驗(yàn)證引物特異性。 ATF3 基因引物序列為正向TTGCCATCCAGAACAAGCACCTC（5′→3′）， 反向GCACTCCGTCTTCTCCTTCTTCTTG（5′→3′）， 平行3 次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Graphpad prism 6.0 軟件進(jìn)行處理， 數(shù)據(jù)用表示， 組間比較采用單因素方差分析。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 中藥注射液對(duì)A2780 細(xì)胞增殖的影響 圖1顯示， 與對(duì)照組比較， 消癌平注射液中、 高劑量組（20、 40 μL／mL）， 艾迪注射液中、 高劑量組（20、40 μL／mL）， 華蟾素注射液中、 高劑量組 （10、20 μL／mL）， 復(fù)方苦參注射液中、 高劑量組（5、10 μL／mL）， 斑蝥酸鈉維生素B6注射液高劑量組（200 μL／mL）， 參芪扶正注射液中、 高劑量（50、100 μL／mL） 組對(duì)A2780 細(xì)胞增殖有顯著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）， 并隨藥物濃度升高而增強(qiáng)。

圖1 中藥注射液對(duì)A2780 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of Chinese herbal injections on A2780 cell proliferation

3.2 中藥注射液對(duì)A2780 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的影響 圖2 顯示， 40 μmol／L 曲格列酮刺激后， A2780 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)明顯升高； 與曲格列酮組比較， 消癌平注射液低劑量組（10 μL／mL）， 華蟾素注射液中、 高劑量組（10、20 μL／mL）， 復(fù)方苦參注射液低、 中劑量組（1、5 μL／mL）， 參芪扶正注射液高劑量組（100 μL／mL）ATF3 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）， 而斑蝥酸鈉維生素B6注射液高劑量組（200 μL／mL）其mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）， 約為對(duì)照組的80 倍。

3.3 中藥注射液對(duì)SK-OV-3 細(xì)胞增殖的影響 圖3 顯示， 與對(duì)照組比較， 艾迪注射液低、 中、 高劑量組 （10、 20、 40 μL／mL）， 華蟾素注射液低、中、 高劑量組（5、 10、 20 μL／mL）， 復(fù)方苦參注射液高劑量組（10 μL／mL）， 斑蝥酸鈉維生素B6注射液高劑量組（200 μL／mL） 對(duì)SK-OV-3 細(xì)胞增殖呈顯著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）， 并隨藥物濃度升高而增強(qiáng)。

3.4 中藥注射液對(duì)SK-OV-3 細(xì)胞中ATF3 mRNA表達(dá)的影響 圖4 顯示， 40 μmol／L 曲格列酮刺激后， A2780 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)明顯升高； 與曲格列酮組比較， 消癌平注射液低劑量組（10 μL／mL）， 艾迪注射液中劑量組（20 μL／mL），華蟾素注射液低、 中劑量組（5、 10 μL／mL）， 復(fù)方苦參注射液低劑量組（1 μL／mL） ATF3 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）； 斑蝥酸鈉維生素B6注射液低、 中、 高劑量組 （50、 100、200 μL／mL） 其mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.01），約為對(duì)照組的100～200 倍。

4 討論

惡性腫瘤的治療和預(yù)后一直是臨床、 基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 以豐富的中草藥寶庫為基礎(chǔ)， 近年來我國研發(fā)了數(shù)十種中藥注射液來輔助臨床常規(guī)的腫瘤治療， 以期達(dá)到協(xié)同增效、 提高患者免疫力、延長生存時(shí)間、 提升生活質(zhì)量的效果， 但其使用是否恰當(dāng)、 是否能通過作用于有效靶點(diǎn)增強(qiáng)抗癌作用、 是否能防止腫瘤轉(zhuǎn)移或免疫逃逸還需要進(jìn)一步考察。

圖2 中藥注射液對(duì)A2780 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Chinese herbal injections on ATF3 mRNA expression in A2780 cells

圖3 中藥注射液對(duì)SK-OV-3 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of Chinese herbal injections on SK-OV-3 cell proliferation

圖4 中藥注射液對(duì)SK-OV-3 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Chinese herbal injections on ATF3 mRNA expression in SK-OV-3 cells

本實(shí)驗(yàn)選擇6 種臨床上常用的抗腫瘤中藥注射液， 其中消癌平注射液是由通關(guān)藤干燥藤莖經(jīng)水提醇沉制成的中藥注射劑[14］， 功效清熱解毒、 化痰散結(jié)， 是肺癌、 肝癌、 消化道腫瘤的治療藥物和化療輔助藥物； 艾迪注射液由人參、 黃芪、 刺五加、斑蝥提取物制成， 臨床用于治療原發(fā)性肝癌、 肺癌、 惡性淋巴瘤、 婦科惡性腫瘤； 華蟾素注射液提取自干蟾皮， 有效成分為蟾蜍毒素類， 可抑制多種惡性腫瘤增殖、 轉(zhuǎn)移， 對(duì)化療非敏感腫瘤的療效良好； 復(fù)方苦參注射液由苦參、 白土苓提取而成， 功效涼血解毒、 散結(jié)止痛， 臨床上主要用于緩解癌腫疼痛、 減少放化療毒副作用； 斑蝥酸鈉維生素B6注射液有效成分為斑蝥酸鈉， 是抗腫瘤活性成分斑蝥素的半合成衍生物， 適用于中晚期肝癌、 肺癌、宮頸癌等治療[11］； 參芪扶正注射液提取自黨參、黃芪， 功效益氣扶正， 臨床上用于癌癥患者放化療中增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和化療敏感性。 上述中藥注射液在臨床使用過程中均可與化療藥物聯(lián)用以抑制腫瘤生長， 但具體機(jī)制未明。

作為一種適應(yīng)性反應(yīng)基因， ATF3 可參與細(xì)胞內(nèi)外復(fù)雜的進(jìn)程， 在靜息細(xì)胞中低表達(dá)， 可被一系列應(yīng)激信號(hào)（如缺氧、 DNA 損傷、 抗癌復(fù)合物等）快速誘導(dǎo)， 它在腫瘤形成發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用， 但其對(duì)腫瘤產(chǎn)生的效應(yīng)是復(fù)雜且矛盾的， 根據(jù)誘導(dǎo)因素、 細(xì)胞類型、 內(nèi)外環(huán)境等不同可表現(xiàn)為促癌或抑癌2 種截然相反的作用。 研究表明[15］，ATF3 過度表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3 的能動(dòng)性及侵襲性， 但也可促進(jìn)其凋亡； Yin 等[7］發(fā)現(xiàn)， 人乳腺癌細(xì)胞中ATF3 被TGF-β 誘導(dǎo)而表達(dá)增加后，可通過上調(diào)Slug、 Snail 等侵襲促進(jìn)因子的轉(zhuǎn)錄來抑制細(xì)胞凋亡， 并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移； Chang 等[16］報(bào)道， ATF3 高表達(dá)可能與使用紫杉醇引起的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移有關(guān)， 沉默該因子后可顯著減少乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)； ATF3 在卵巢癌中作用的研究報(bào)道較少，目前已有報(bào)道該因子在晚期卵巢乳頭狀漿液性癌老年患者中表達(dá)升高， 并與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率直接相關(guān)[17］，有研究已將抑制其作為評(píng)價(jià)卵巢癌有效治療和是否有轉(zhuǎn)移可能的重要指標(biāo)[18-19］。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)6 種中藥注射劑對(duì)2 種卵巢癌細(xì)胞A2780、 SK-OV-3 增殖的抑制率及ATF3 mRNA 表達(dá)。 前期報(bào)道， 曲格列酮可作為ATF3 陽性誘導(dǎo)劑， 刺 激 其 mRNA 表 達(dá) 升 高[13］， 本 實(shí) 驗(yàn) 選 擇40 μmol／L作為誘導(dǎo)劑量。 結(jié)果表明， 各中藥注射液在一定濃度內(nèi)均可抑制A2780、 SK-OV-3 細(xì)胞增殖， 并呈濃度依賴性， 其中消癌平注射液在不影響腫瘤細(xì)胞增殖的低濃度下可抑制ATF3 mRNA 表達(dá)； 艾迪注射液對(duì)A2780 細(xì)胞中ATF3 mRNA 表達(dá)的作用不明顯， 但20 μL／mL 下可抑制SK-OV-3 細(xì)胞增殖， 并對(duì)其mRNA 表達(dá)有抑制作用； 較低濃度華蟾素注射液對(duì)2 種細(xì)胞增殖率及ATF3 mRNA表達(dá)均有抑制作用； 高濃度（100 μL／mL） 參芪扶正注射液可抑制A2780 增殖， 并下調(diào)ATF3 mRNA表達(dá)； 消癌平注射液、 艾迪注射液、 華蟾素注射液、 復(fù)方苦參注射液在較高濃度時(shí)有誘導(dǎo)ATF3 mRNA 高表達(dá)的趨勢(shì)， 雖然不明顯， 但仍應(yīng)引起研究者重視； 斑蝥酸鈉維生素B6注射液對(duì)卵巢癌細(xì)胞中ATF3 的誘導(dǎo)能力非常強(qiáng)， 可將其mRNA 表達(dá)增加至約 100 倍以上， 可能與其濃度太高（200 μL／mL） 引起細(xì)胞應(yīng)激有關(guān)， 也有可能是斑蝥酸鈉可直接誘導(dǎo)其mRNA 表達(dá)， 該中藥注射液作為抗腫瘤藥物或放化療輔助藥物使用時(shí)， 是否可能通過誘導(dǎo)ATF3 來引起腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)驗(yàn)。

綜上所述， 華蟾素注射液可抑制卵巢癌細(xì)胞A2780、 SK-OV-3 的增殖， 并下調(diào)ATF3 mRNA 表達(dá)， 而斑蝥酸鈉維生素B6注射液可大幅上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中其mRNA 表達(dá)。 中藥注射劑要求大量基礎(chǔ)研究去闡明其作用機(jī)制， 而ATF3 作為與腫瘤凋亡、 轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要作用靶點(diǎn)， 有望作為評(píng)價(jià)藥物抗癌及預(yù)后的指標(biāo)之一。