吳 萍， 高 陸， 田淋淋， 任 晶， 白 冰， 徐 建?

（1. 吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司， 吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 長春 130103；2. 修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司， 吉林 通化 134100）

六味地黃方出自錢乙《小兒藥證直訣》， 由熟地黃、 牡丹皮、 酒萸肉、 山藥、 澤瀉、 茯苓組成，用于腎陰虧損、 頭暈耳鳴、 腰膝酸軟、 骨蒸潮熱、盜汗遺精、 消渴[1］， 六味地黃膠囊是其精制產(chǎn)品，服用量小， 廣泛應(yīng)用于臨床。 在中藥生產(chǎn)中， 工藝參數(shù)及生產(chǎn)過程質(zhì)量控制對制劑的有效性、 均一性、 穩(wěn)定性有著較大影響， 但目前關(guān)于六味地黃膠囊的研究大多涉及質(zhì)量控制， 而鮮有工藝研究及生產(chǎn)過程質(zhì)量控制的報道。 因此， 本實(shí)驗(yàn)以六味地黃膠囊主要藥效成分莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷[2-3］為評價指標(biāo)， 對大孔吸附樹脂純化工藝進(jìn)行優(yōu)化[4-6］， 以期保證該制劑均一穩(wěn)定， 質(zhì)量可靠。

1 材料

1.1 儀器 Ultimae-3000 雙三元高效液相色譜儀（美國戴安公司）； AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 芍藥苷（批號110736-201741）、 莫諾苷（批號111998-201602）、 馬錢苷（批號111640-201605） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測定[7-12］

2.1.1 色譜條件 Kromasil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流 動 相 甲 醇-0.1% 磷 酸（20 ∶80）； 檢測波長240 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量1.0 mL／min； 進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷對照品適量， 甲醇制成每l mL 分別含50、 30、 30 μg 上述成分的溶液， 即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取供試液10 mL，置于具塞錐形瓶中蒸干， 精密加入25 mL 甲醇， 稱定質(zhì)量， 超聲（250 W、 50 kHz） 30 min， 放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、5、 8、 10、 15 μL， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 得到莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷回歸方程分別為Y=16.872X＋0.068 （r=1.000 0）、Y=26.133X＋0.352 9 （r=1.000 0）、 Y=26.611X＋1.271 5 （r=0.980 0）， 分別在0.118 2 ～0.886 5、0.442 6～3.319 5、 0.051 ～0.382 5 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化

2.2.1 上樣液前處理 稱取酒萸肉（176 g） 醇提后藥渣、 牡丹皮（132 g） 水蒸氣蒸餾后水溶液和藥渣、 熟地黃352 g、 澤瀉132 g、 山藥176 g， 加水煎煮3 次， 加水量依次為6、 4、 4 倍量， 每次1 h， 濾過， 濾液合并[1］， 濃縮至7 000 m L （每1 mL藥液含生藥材0.14 g）， 莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量分別為0.093、 0.057、 0.139 mg／mL。

2.2.2 泄漏曲線繪制 取濕D101 大孔吸附樹脂15 g， 裝入層析柱（內(nèi)徑1.5 cm、 高20 cm） 中，徑高比1 ∶4。 另取“2.2.1” 項(xiàng)下水煎液200 mL上樣， 體積流量1 mL／min， 每20 mL 收集1 份，共10 份， 測定每份泄漏液中芍藥苷、 莫諾苷、 馬錢苷含有量， 以泄漏量為縱坐標(biāo)， 上樣量為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線， 結(jié)果見圖2。 由圖可知， 上樣60 mL時莫諾苷開始泄漏， 80 mL 時其他2 種成分也開始泄漏。

圖2 各成分泄漏曲線Fig.2 Leakage curves for various constituents

表1 藥液-樹脂用量比例考察結(jié)果Tab.1 Results of drug liquid-resin consumption ratio investigation

2.2.3 藥液-樹脂用量比例考察 取3 根相同型號的層析柱（內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm）， 按徑高比1 ∶4 裝 柱， 濕 樹 脂 量15 g， 上 樣 量 75、 60、45 mL， 即藥液-樹脂用量比例5 ∶1、 4 ∶1、 3 ∶1，上樣后純化水洗脫， 收集水洗液， 計(jì)算泄漏量和泄漏率， 結(jié)果見表1。 由表可知， 最佳藥液-樹脂用量比例為3 ∶1。

2.2.4 樹脂徑高比考察 取3 份濕樹脂， 每份15 g， 分別裝入不同型號樹脂柱中， 使徑高比為1 ∶3、 1 ∶4、 1 ∶5， 各取45 mL 藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無色， 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液，置于恒重的蒸發(fā)皿中蒸干， 測定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量， 計(jì)算收率， 公式為收率= （C1×V1／C2×V2） ×100%， 其中C1為洗脫液中莫諾苷／馬錢苷／芍藥苷含有量， V1為洗脫液體積， C2為水提濃縮液中莫諾苷／馬錢苷／芍藥苷含有量， V2為上樣液體積， 結(jié)果見表2。 由表可知， 最佳樹脂徑高比為1 ∶4。

表2 樹脂徑高比考察結(jié)果（n=3）Tab.2 Results of resin diameter-height ratio investigation （n=3）

2.2.5 吸附體積流量考察 取3 份濕樹脂， 每份15 g， 分別裝入3 根相同型號的層析柱 （內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取45 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無色， 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液， 置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量，按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見表3。 由表可知， 最佳吸附體積流量為2 BV／h。

表3 吸附體積流量考察結(jié)果Tab.3 Results of adsorption volume flow rate investigation

2.2.6 洗脫體積流量考察 取3 份濕樹脂， 每份15 g， 分別裝入3 根相同型號的層析柱 （內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取45 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無色， 70%乙醇洗脫， 洗脫體積流量1、 2、 3 BV／h， 收集洗脫液，置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量， 按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見表4。 由表可知， 最佳洗脫體積流量為2 BV／h。

2.2.7 洗脫劑用量考察 取3 份濕樹脂， 每份約15 g， 分別裝入3 根相同型號的層析柱（內(nèi)徑1.5 cm， 高20 cm） 中， 徑高比1 ∶4， 各取75 mL藥液上樣， 純化水洗滌至流出液無色， 3、 4、 5 BV 70%乙醇洗脫， 收集洗脫液， 置于恒重蒸發(fā)皿中蒸干， 測定固形物量及殘?jiān)心Z苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量， 按“2.2.4” 項(xiàng)下公式計(jì)算收率， 結(jié)果見表5。 由表可知， 最佳洗脫劑用量為5 BV。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化后的大孔吸附樹脂純化條件進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)， 結(jié)果見表6。 由表可知， 3批純化物中固形物得率及莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷含有量RSD 均小于3%， 收率與工藝研究結(jié)果一致， 表明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 洗脫體積流量考察結(jié)果Tab.4 Results of elution volume flow rate investigation

表5 洗脫劑用量考察結(jié)果Tab.5 Results of eluent consumption investigation

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

3 討論

中藥血清藥物化學(xué)研究表明， 六味地黃制劑經(jīng)口服吸收入血、 在血清中含有量相對較高的藥效成分主要為莫諾苷、 馬錢苷、 芍藥苷[2-3］， 故選擇三者作為檢測指標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)所采用的因素對大孔吸附樹脂分離純化效果均有較大影響[4-7］， 其中藥液-樹脂用量比例考察項(xiàng)下的藥液上樣量是依據(jù)泄漏曲線測定結(jié)果而設(shè)定。

另外， 本實(shí)驗(yàn)取濕D101 型大孔吸附樹脂反復(fù)上樣、 洗脫、 再生， 發(fā)現(xiàn)同一份樹脂再生后反復(fù)使用3 次， 莫諾苷、 芍藥苷吸附量與首次洗脫液相比下降30%時， 可確定為樹脂使用周期。

綜上所述， 優(yōu)化后的六味地黃膠囊大孔吸附樹脂純化工藝合理可行， 主要藥效成分收率穩(wěn)定， 可用于該制劑的生產(chǎn)。