吳人杰，許平翠，壽旦，李功華，蘭青山，王娜妮#

（1.浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心，杭州310007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310053；3.北京華邈藥業(yè)有限公司，北京 102600）

薏苡仁收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），為禾本科植物薏苡[Coix lacryma-jobiL.var.mayuen.（Roman.）Stapf］的干燥成熟種仁，具有健脾利濕、除痹止瀉、清熱排膿等功效，用于治療水腫、腳氣、小便不利、濕痹拘攣、脾虛泄瀉、肺癰、腸癰、扁平疣等疾病[1］。薏苡仁的主要活性成分包括酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內(nèi)酰胺類等[2］。有研究表明，薏苡仁及其活性成分具有抗腫瘤、抗炎、提高免疫力、降糖等藥理作用[3］。其中，研究者對(duì)薏苡仁油的關(guān)注頗多。薏苡仁油是從薏苡仁的種核中提取的，有研究證實(shí)薏苡仁油具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和提高免疫力的作用，可用于肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤的治療[4-5］。薏苡仁油中主要抗腫瘤成分是甘油三酯類成分[6］，包括甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-油酸甘油酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1，2-油酸-3-亞油酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯等，但上述成分的對(duì)照品來源有限且價(jià)格昂貴，增加了檢測(cè)成本。目前，薏苡仁抗腫瘤成分的含量測(cè)定方法主要采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法（HPLC-ELSD）[7］，研究的主要成分是甘油三油酸酯，而針對(duì)其他甘油酸酯類成分的研究較少，故難以全面有效地評(píng)價(jià)薏苡仁的質(zhì)量。鑒于此，筆者采用一測(cè)多評(píng)法，以常見易得、檢測(cè)技術(shù)成熟的甘油三油酸酯為內(nèi)標(biāo)，分別計(jì)算其與甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的相對(duì)校正因子（RCF），利用RCF測(cè)定上述成分的含量，并將結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，旨在實(shí)現(xiàn)薏苡仁中4種甘油三酯類抗腫瘤成分的同時(shí)測(cè)定及檢驗(yàn)成本的降低。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括Alltech 2000型ELSD（日本Shimadzu公司）；U3000型HPLC儀，包括Alltech 3300型ELSD（美國(guó)Thermo公司）；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；AE 50型電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司］；800A型多功能粉碎機(jī)（永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘油三油酸酯對(duì)照品（批號(hào):111692-201605，純度:＞99%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘油三亞油酸酯對(duì)照品（批號(hào):B26382，純度:＞95%）、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯對(duì)照品（批號(hào):D460615，純度:＞98%）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯對(duì)照品（批號(hào):CFADP8577，純度:＞98%）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈、異丙醇為色譜純，石油醚（60～90℃）為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批薏苡仁飲片樣品經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院藥用資源研究中心浦錦寶研究員鑒定為薏苡[Coix lacrymajobiL.var.mayuen.（Roman.）Stapf］的干燥成熟種仁，其來源見表1。采用多功能粉碎機(jī)將10批薏苡仁打粉過3號(hào)篩，備用。

表1 薏苡仁樣品來源Tab 1 Source of C.lacryma samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-異丙醇（57∶43，V/V）；流速:1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。ELSD漂移管溫度：70℃；氣體流速:2 L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯對(duì)照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別取上述對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相配制質(zhì)量濃度分別為0.15、0.15、0.35、0.35 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取薏苡仁粉末3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入石油醚30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率:300 W，頻率:28 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用石油醚補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，減壓濃縮脫去石油醚，獲得薏苡仁油。取薏苡仁油30 mg，加流動(dòng)相溶解，并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 取流動(dòng)相作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯質(zhì)量濃度分別為0.15、0.15、0.35、0.35 mg/mL的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各被測(cè)成分之間、被測(cè)成分與雜質(zhì)峰均達(dá)到基線分離，4種成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計(jì)應(yīng)不低于5 000，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、20、30 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)、峰面積的對(duì)數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。

調(diào)查問卷中態(tài)度部分共8個(gè)題項(xiàng)。受訪者對(duì)抗生素用藥的總體態(tài)度得分為31.71±3.93，得分范圍是8～40，表明醫(yī)生對(duì)抗生素的態(tài)度正確率處于中等水平。仍有25.2%的醫(yī)生非常同意或同意抗生素的靜脈注射比口服用藥效果更好；有31.7%的醫(yī)生非常同意或同意抗生素可預(yù)防急性上呼吸道感染的并發(fā)癥，受訪者對(duì)各題項(xiàng)的回答情況見表3。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Results of linear relationship investigation

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

分別取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯的定量限分別為 0.13、0.06、0.07、0.12 μg，檢測(cè)限分別為 0.04、0.02、0.02、0.03 μg。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯峰面積的RSD分別為0.89%、0.69%、0.55%、0.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào):YYR09），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯峰面積的RSD分別為1.88%、1.13%、1.24%、1.01%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末（批號(hào):YYR09）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯的平均含量分別為 0.70、0.49、0.75、0.91 μg/g，RSD 分別為 1.08%、1.04%、1.06%、1.16%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品粉末（批號(hào):YYR09）適量，共6份，每份約3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定含量

2.10.1 RCF的計(jì)算 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 1、5、10、20、30 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以甘油三油酸酯為內(nèi)標(biāo)，按公式fs/k＝fs/fk＝ck×As/cs×Ak（式中，cs為內(nèi)標(biāo)濃度，ck為待測(cè)物濃度，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，Ak為待測(cè)物峰面積）[8］，分別計(jì)算甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的RCF，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

表4 3種成分的RCF考察結(jié)果Tab 4 Results of RCF of 3 components

表5 不同色譜儀和不同色譜柱條件下測(cè)得的RCF Tab 5 RCF determined by different instruments andcolumns

2.10.3 待測(cè)組分色譜峰的定位 在無對(duì)照品的條件下，準(zhǔn)確定位每個(gè)色譜峰是一測(cè)多評(píng)法成功應(yīng)用的關(guān)鍵，可采用相對(duì)保留時(shí)間（rk/s）進(jìn)行峰定位[9］。其中，rk/s=tR（k）/tR（s）[式中，tR（k）為待測(cè)物保留時(shí)間，tR（s）為內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間］。本研究利用甘油三油酸酯對(duì)甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的rk/s進(jìn)行定性，測(cè)得各成分rk/s的RSD均小于5%，表明利用rk/s進(jìn)行色譜峰的定位可行，結(jié)果詳見表6。

表6 不同色譜儀和不同色譜柱條件下測(cè)得的rk/sTab 6 Relative retention time determined by differentinstruments and columns

2.11 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

取10批薏苡仁樣品粉末，平行3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定薏苡仁中4種甘油三酯類成分的含量，結(jié)果見表7。采用SPSS 19.0軟件對(duì)兩種方法所測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果，各待測(cè)成分含量檢測(cè)結(jié)果組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 7 Results of contents determination of samples（n＝3，μg/g）

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇

甘油三酯類成分是薏苡仁中含有的主要活性成分之一，藥理活性顯著，且與薏苡仁的功效具有相關(guān)性[10］，是評(píng)價(jià)薏苡仁質(zhì)量的適宜指標(biāo)。另外，目前的研究很少涉及甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的含量，但是以上化合物都具有顯著的抗腫瘤活性[11］，其作用強(qiáng)度不亞于甘油三油酸酯。因此，筆者選擇同時(shí)測(cè)定4種甘油三酯類成分的含量。

3.2 檢測(cè)方法的選擇

一測(cè)多評(píng)法是利用廉價(jià)易得的典型化學(xué)成分為對(duì)照，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分同時(shí)測(cè)定，能從整體上對(duì)中藥、飲片及制劑的質(zhì)量進(jìn)行控制[12-13］，此方法已在黃連[9］、川芎[14］、知母[15］、山茱萸[16］、黃芩[17］等藥材及中藥制劑中得以驗(yàn)證。本試驗(yàn)選擇可靠、成熟的外標(biāo)法[18］測(cè)得數(shù)據(jù)結(jié)果與一測(cè)多評(píng)法測(cè)得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比來驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果證明，一測(cè)多評(píng)法適合評(píng)價(jià)薏苡仁多種甘油三酯類成分的含量，有助于全面反映該類中藥飲片的質(zhì)量水平。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

薏苡仁中甘油三酯類成分復(fù)雜且易分解和聚合，成本較高，甘油三油酸酯作為薏苡仁的指標(biāo)性化合物，相較于其他甘油三酯類成分穩(wěn)定、易得，含量適中，且國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其均有相關(guān)研究報(bào)道[19］。同時(shí)，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）也將其作為薏苡仁含量控制指標(biāo)成分，因此筆者選擇薏苡仁作為一測(cè)多評(píng)法的內(nèi)標(biāo)。本文研究結(jié)果表明，甘油三油酸酯作為內(nèi)標(biāo)，能夠反映其他3種甘油三酯類成分的含量，具有較好的代表性。

3.4 色譜條件的選擇

在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中薏苡仁含量測(cè)定所用流動(dòng)相為乙腈-二氯甲烷[1］。但經(jīng)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷對(duì)HPLC系統(tǒng)管路有腐蝕性，造成管路易堵，樣品含量測(cè)定不準(zhǔn)確[20］，故本試驗(yàn)選擇乙腈-異丙醇為流動(dòng)相。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果分析

由表7可知，來自8個(gè)不同產(chǎn)地薏苡仁飲片中甘油三酯類成分含量在0.33～2.76 μg/g范圍內(nèi)。其中，1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯和甘油三油酸酯的含量相對(duì)較高，甘油三亞油酸酯和1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯的含量相對(duì)較低；此外結(jié)果還顯示，不同產(chǎn)地薏苡仁中甘油三酯類成分含量差異較明顯，貴州產(chǎn)薏苡仁中4種化學(xué)成分相較于其他產(chǎn)地均偏高，而浙江、重慶、廣西產(chǎn)地薏苡仁中4種化學(xué)成分相較于其他產(chǎn)地均偏低。這可能是因?yàn)橘F州是薏苡仁的主產(chǎn)區(qū)，而甘油三酯類成分含量與其種植環(huán)境和種植技術(shù)密切相關(guān)[21］。

4 結(jié)語

文獻(xiàn)報(bào)道甘油三油酸酯是薏苡仁的主要活性成分[22］，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯也具有抗腫瘤活性[23］，甘油三酯類成分的含量對(duì)薏苡仁藥效的發(fā)揮具有重要意義[24］。本研究通過建立薏苡仁一測(cè)多評(píng)法計(jì)算出薏苡仁中甘油三酯類成分的RCF，并考察了不同HPLC儀、不同色譜柱對(duì)其的影響，實(shí)測(cè)結(jié)果顯示其與外標(biāo)法相比無明顯差異。由此可見，在僅有甘油三油酸酯對(duì)照品的情況下，可利用一測(cè)多評(píng)法對(duì)薏苡仁其他甘油三酯類成分含量進(jìn)行估算。此法對(duì)薏苡仁的質(zhì)量控制具有重要意義，也可為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。