門麗嬌，劉亞迪，邱雨，袁旭江

（廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣州510006）

N-反式對香豆酰酪氨酸[N-（E）-p-coumaroyltyrosine］為酚類氨基酸衍生物，最早被發(fā)現(xiàn)于非洲黑木樹皮中[1］。隨著研究的不斷深入，至今發(fā)現(xiàn)含有該成分的植物還有可可[2］、山茱萸根[3］、闊葉野韭菜花和莖[4］、常春藤新鮮葉子[5］等。在生物活性方面，Osakabe N[6］通過實驗動物模型研究了含有N-反式對香豆酰酪氨酸的可可提取液中粗多酚的生物活性，結果表明其對乙醇誘導的胃潰瘍具有一定的保護作用，可抑制維生素E缺乏大鼠的氧化應激，降低高膽固醇血癥模型兔的氧化敏感性，抑制小鼠皮膚的癌變，同時還可抑制雜環(huán)胺的致突變作用。Mokhtar M等[7］研究發(fā)現(xiàn)，辣椒多酚提取物具有抗菌和抗氧化活性，可降低癌細胞的活力，而N-反式對香豆酰酪氨酸是該提取物可能發(fā)揮生物活性的成分之一。抑制一氧化氮（NO）合酶介導的NO過表達可能是治療包括神經(jīng)炎性疾病在內(nèi)的炎癥性疾病的藥物靶點。Hu XL等[8］利用酶活性和對接試驗顯示，N-反式對香豆酰酪氨酸對誘導型靶標產(chǎn)生的NO合酶有抑制作用。由此可見，N-反式對香豆酰酪氨酸具有多種生物活性，但其在植物純化富集和分析方面的研究較少。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，雞骨草葉中含有N-反式對香豆酰酪氨酸，且含量較高[9-10］。為此，本研究在建立測定雞骨草葉中N-反式對香豆酰酪氨酸含量高效液相色譜法（HPLC）的基礎上，采用單因素試驗優(yōu)化N-反式對香豆酰酪氨酸的純化工藝，旨在為其開發(fā)利用和質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、真空脫氣機、四元泵、自動進樣器和柱溫箱（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；JJ1000型千分之一電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；BHS-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

N-反式對香豆酰酪氨酸對照品（廣東藥科大學新藥研發(fā)中心自制，批號:20180601，純度:＞99%）；聚酰胺樹脂（100～200目，臺州市路橋四甲生化塑料廠）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

24批雞骨草葉藥材（編號:S1～S24）經(jīng)廣東藥科大學新藥研發(fā)中心袁旭江副研究員鑒定分別為豆科（Leguminosae）植物相思子屬（Abrus Adans.）的廣州相思子（Abrus cantoniensisHance）或毛相思子（Abrus mollisHance）的干燥葉。藥材樣品來源見表1。

表1 藥材樣品來源Tab 1 Source of medicinal sample

2 方法與結果

2.1 N-反式對香豆酰酪氨酸的含量測定

2.1.1色譜條件色譜柱1:Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20 min，33%B→51%B）；流速:1.0 mL/min；柱溫:25℃；檢測波長:300 nm；進樣量:10 μL。在該色譜條件下，N-反式對香豆酰酪氨酸色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000，陰性對照對測定無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 對照品溶液的制備 取N-反式對香豆酰酪氨酸對照品適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為5.15 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品2.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，按照1∶30的比例（g/mL）加入20%乙醇，于95℃加熱回流3次，每次1 h，濾過，合并3次濾液，減壓回收至無醇味，濃縮液加水定容至50 mL。取全部樣品上聚酰胺柱（100～200目，5.0 g，濕法上柱，直徑2.5 cm，長40 cm），上樣流速1.0 mL/min，依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）洗脫至流出液無色后，再用氨水（pH 10）洗脫至無色，收集氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣置于50 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并定容。取適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 取50%乙醇適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得陰性對照溶液。

2.1.5 線性關系及不同色譜柱適用性考察 取“2.1.2”項下對照品溶液0.5、1、2、5、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%乙醇定容，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得N-反式對香豆酰酪氨酸回歸方程為y＝441.34x－8.259 4（r＝0.999 9）（色譜柱1）；y＝447.20x－64.309 0（r＝0.999 9）[色譜柱 2:Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）］，表明N-反式對香豆酰酪氨酸檢測進樣量的線性范圍為2.575～51.50 μg，詳見表2。

表2 不同色譜柱的線性關系及適用性考察結果Tab 2 Linear range of different chromatogram column and suitability

2.1.6 定量限與檢測限考察 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸的定量限為0.000 618 μg、檢測限為0.000 129 μg。

2.1.7 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號:S15）10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件于同日內(nèi)連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸峰面積的RSD為1.15%（n＝6），表明本方法日內(nèi)精密度良好。精密量取“2.1.3”項下供試品溶液（編號:S15）10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定3 d，記錄峰面積。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸峰面積的RSD為1.14%（n＝3），表明本方法日間精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號:S15）適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸峰面積的RSD為0.30%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 重復性試驗 取藥材樣品（編號:S15）適量，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品含量。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸的平均含量為11.81 mg/g，RSD為2.43%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取已知含量的藥材樣品（編號:S15）1.0 g，精密稱定，共6份，分別加入一定量的N-反式對香豆酰酪氨酸對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.11 樣品含量測定 取24批樣品，每批2.0 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按回歸方程計算樣品含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3）

2.1.12 干膏含量及干膏純度測定 供試品溶液用氨水洗脫后，定容至50 mL，取40 mL，按2015年版《中國藥典》（三部）通則干燥失重法干燥后得樣品干膏[11］，并計算干膏含量及干膏純度。干膏含量（mg/g）＝（減失的質量×5/4）/樣品質量；干膏純度（%）＝N-反式對香豆酰酪氨酸在樣品中的含量/干膏含量×100%，結果見表4；干膏含量與干膏純度的相關性散點圖見圖2。由圖2可知，干膏含量與干膏純度存在線性關系（R2＝0.834 1）。

圖2 相關性散點圖Fig 2 Scattered plot of correlation

2.2 N-反式對香豆酰酪氨酸純化工藝優(yōu)化

2.2.1 純化前樣品溶液制備 取藥材樣品40.0 g，置于圓底燒瓶中，按照1∶30的比例（g/mL）加入20%乙醇，于95℃加熱回流3次，每次1 h，濾過，合并3次濾液，減壓回收至無醇味，濃縮液加水定容至1 000 mL，即得。

2.2.2 洗脫溶劑考察 稱取聚酰胺樹脂5.0 g，共2份，每份分為2柱，分別濕法上柱，取“2.2.1”項下樣品溶液50 mL，上樣流速1.0 mL/min，靜置吸附時間20 min，樣品溶液質量濃度0.04 g/mL（以雞骨草葉藥材計，下同），每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脫至流出液無色，分別收集水洗脫液、乙醇洗脫液和氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣加50%乙醇定容至25 mL，每個樣品平行2份，取適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，水洗脫液、乙醇洗脫液中N-反式對香豆酰酪氨酸得率均為0，但水溶性雜質和黃酮類成分被洗脫，氨水洗脫液中N-反式對香豆酰酪氨酸得率分別為96.27%、100.03%，提示N-反式對香豆酰酪氨酸被富集在氨水洗脫液中，故選擇用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）為洗脫溶劑依次洗脫，并收集氨水洗脫液進行含量測定（氨水洗脫液中N-反式對香豆酰酪氨酸的質量/樣品溶液中N-反式對香豆酰酪氨酸的質量×100%）。

2.2.3 靜置吸附時間考察 稱取聚酰胺樹脂5.0 g，共6份，分為3組（每組2柱），分別濕法上柱，取“2.2.1”項下樣品溶液50 mL，上樣流速1.0 mL/min，樣品溶液質量濃度0.04 g/mL，每組分別靜置吸附5、10、20 min，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脫至流出液無色，棄去水洗脫液、乙醇洗脫液，分別收集每柱的氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣加50%乙醇定容至25 mL，每個樣品平行2份，取適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸得率分別為94.34%、98.65%、99.65%。這提示靜置吸附時間越長，N-反式對香豆酰酪氨酸吸附得越緊密，在前期經(jīng)水、乙醇洗脫時越不易隨雜質洗脫，綜合考慮，最終選擇靜置吸附時間為20 min。

2.2.4 上樣量考察 稱取聚酰胺樹脂5.0 g，共6份，分為3組（每組2柱），分別濕法上柱，取“2.2.1”項下樣品溶液30、50、70 mL，上樣流速1.0 mL/min，靜置吸附時間20 min，樣品溶液質量濃度0.04 g/mL，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脫至流出液無色，棄去水洗脫液、乙醇洗脫液，分別收集每柱的氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣加50%乙醇定容至25 mL，每個樣品平行2份，取適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸得率分別為100.11%、100.02%、97.05%。這提示當上樣量為70 mL時，N-反式對香豆酰酪氨酸不能被聚酰胺樹脂完全吸附，綜合考慮，最終選擇上樣量為50 mL。

2.2.5 樣品溶液質量濃度考察 稱取聚酰胺樹脂5.0 g，共6份，分為3組（每組2柱），分別濕法上柱，取“2.2.1”項下樣品溶液50 mL，分別制成質量濃度為0.02、0.04、0.06 g/mL的上樣液，上樣流速1.0 mL/min，靜置吸附時間20 min，每柱依次用水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）洗脫至流出液無色，棄去水洗脫液、乙醇洗脫液，分別收集每柱的氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣加50%乙醇定容至25 mL，每個樣品平行2份，取適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸得率分別為101.32%、100.22%、100.42%。這提示當樣品溶液質量濃度為0.02～0.06 g/mL時，N-反式對香豆酰酪氨酸均可被全部洗脫下來，考慮到實際操作，最終選擇樣品溶液質量濃度為0.04 g/mL。

2.2.6 酸性洗脫溶劑含酸量考察 稱取聚酰胺樹脂5.0 g，共6份，分為3組（每組2柱），分別濕法上柱，取“2.2.1”項下樣品溶液50 mL，上樣流速1.0 mL/min，靜置吸附時間20 min，樣品溶液質量濃度0.04 g/mL，每柱依次用不含乙酸、含0.1%乙酸、含0.2%乙酸的水和不含乙酸、含0.1%乙酸、含0.2%乙酸的20%乙醇、氨水（pH 10）洗脫至流出液無色，棄去水洗脫液、乙醇洗脫液，分別收集每柱的氨水洗脫液，減壓濃縮至干，殘渣加50%乙醇定容至25 mL，每個樣品平行2份，取適量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，N-反式對香豆酰酪氨酸得率分別為0、100.20%、101.12%。這提示在洗脫溶劑中增加適量的乙酸可使N-反式對香豆酰酪氨酸在聚酰胺樹脂上的吸附力加大，提高得率，考慮到經(jīng)濟成本，最終選擇酸性洗脫溶劑為水（含0.1%乙酸）。

2.2.7 驗證試驗 按上述考察結果得到最優(yōu)純化工藝為0.04 g/mL樣品溶液50 mL、上樣流速1.0 mL/min、靜置吸附時間20 min，以水（含0.1%乙酸）、20%乙醇（含0.1%乙酸）、氨水（pH 10）為洗脫溶劑依次洗脫，在此純化工藝條件下制備N-反式對香豆酰酪氨酸，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，結果見表5。

表5 驗證試驗結果（n＝3）Tab 5 Results of verification test（n＝3）

3 討論

雞骨草葉總提取液工藝可將N-反式對香豆酰酪氨酸完全提取。筆者在富集純化時通過比較發(fā)現(xiàn)，使用聚酰胺樹脂比硅膠、大孔樹脂吸附效果更好，且提取液中加入少量乙酸可較好地促進目標成分的吸附，去除黃酮類等雜質。故選擇洗脫溶劑、靜置吸附時間、上樣量、樣品溶液質量濃度和酸性洗脫劑含酸量為考察因素，進一步探討這些因素對N-反式對香豆酰酪氨酸純化富集的影響，以篩選出最佳工藝參數(shù)，為后期高純度單體制備提供依據(jù)。

本研究采用HPLC法進行含量測定時，得到了較為單一的N-反式對香豆酰酪氨酸峰，這為N-反式對香豆酰酪氨酸的分析和質量評價提供了有利的分析條件。通過不同色譜柱適用性和方法學考察，發(fā)現(xiàn)該方法專屬性較強，且色譜柱的長短對該成分的分析無顯著影響。為實現(xiàn)快速分析，本試驗最終采用短柱進行含量測定。

筆者通過對不同來源雞骨草葉進行含量測定時發(fā)現(xiàn)，廣州相思子和毛相思子的樣品含量范圍分別為3.18～25.70、7.95～31.85 mg/g；相對于廣東，廣西產(chǎn)雞骨草葉中N-反式對香豆酰酪氨酸含量相對較低，提示產(chǎn)地不同可導致成分含量存在一定的差異；另外，采收期的不同也可使樣品含量存在一定的差異[12］，但是否具有規(guī)律性有待后續(xù)研究進一步探討。不同來源雞骨草葉中N-反式對香豆酰酪氨酸干膏純度為4.95%～61.99%，經(jīng)相關性分析結果顯示，干膏純度與干膏含量存在線性關系，這為后期N-反式對香豆酰酪氨酸的進一步純化及單體制備的選材奠定了基礎。

綜上所述，所建含量測定方法簡便、準確、穩(wěn)定性較好；優(yōu)化所得工藝穩(wěn)定、可行。