孫曉莉 田壽樂(lè) 沈廣寧,* 姜倩倩 許 林

(1 山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000；2 濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濰坊 261061)

植物生長(zhǎng)過(guò)程中離不開(kāi)水分，缺水會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，減緩植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)貯藏和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。隨著全球氣候變暖，干旱日益成為限制作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要因子，因此，研究植物耐旱性具有重要意義。干旱導(dǎo)致土壤水分含量降低，而根系作為受土壤干旱脅迫最敏感的部位，其正常生理過(guò)程首先受到干擾[1]。干旱會(huì)抑制根系呼吸，影響呼吸代謝相關(guān)酶活性，導(dǎo)致根系吸收、運(yùn)輸水分和養(yǎng)分等功能紊亂[2-3]。板栗(Castaneamollissima)原產(chǎn)自中國(guó)，是我國(guó)栽培最早的果樹(shù)樹(shù)種之一，也是重要的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，不僅可作為食物、木材、藥材等，還可涵養(yǎng)水分、防止水土流失、維持生物多樣性等。栽培栗樹(shù)可以開(kāi)發(fā)干旱瘠薄的砂石山區(qū)，具有生態(tài)保護(hù)功能，但隨著山區(qū)水資源缺乏的問(wèn)題日益突出[4]，干旱已成為限制板栗生產(chǎn)的主要土壤環(huán)境因子，是導(dǎo)致板栗減產(chǎn)的重要原因之一，尤其在板栗開(kāi)花期與灌漿期[5]，因此探討板栗耐旱性具有重要意義。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三大內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。研究表明，高濃度H2S具有生物毒性，會(huì)導(dǎo)致葡萄、苜蓿、生菜等植物葉片脫落，抑制氧的釋放和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，減緩植物生長(zhǎng)[6-7]；而生理濃度H2S可調(diào)節(jié)植物氣孔運(yùn)動(dòng)、延緩植物衰老、促進(jìn)根系延伸、促進(jìn)種子萌發(fā)、提高光合作用，增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫(如鹽脅迫、干旱脅迫、溫度脅迫、重金屬脅迫、低氧脅迫等)的抗性[8-11]。H2S對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用具有劑量效應(yīng)。García-Mata等[12]研究表明，干旱脅迫下硫氫化鈉(NaHS)處理可以提高蠶豆和蘇丹鳳仙花的相對(duì)含水量并緩解植物受到的干旱損傷；Zhang等[13]研究表明，H2S可清除膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的過(guò)量活性氧(reuctive oxygen species, ROS)，降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，提高相關(guān)抗氧化酶活性，從而有效增強(qiáng)甘薯、大豆和擬南芥的抗旱能力；Jin等[14]研究表明，干旱脅迫下H2S處理能進(jìn)一步刺激干旱相關(guān)L-CD/D-CD1基因的表達(dá)，提高擬南芥幼苗的存活率；劉晶等[15]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，NaHS處理的水稻種子萌發(fā)效果較佳，這是由于干旱脅迫下，H2S可通過(guò)提高水稻種子抗氧化酶活性，解除對(duì)可溶性蛋白合成的抑制，進(jìn)而抑制質(zhì)膜透性增加，提高水稻種子的抗旱性；單長(zhǎng)卷等[16]研究表明，外源一定濃度H2S能夠影響玉米葉片及根系的水分特征，提高玉米葉片及根系的相對(duì)含水量，增強(qiáng)玉米幼苗的抗旱性。山東省果樹(shù)研究所板栗育種與栽培課題組前期研究結(jié)果表明，15% PEG脅迫下添加0.5 mmol·L-1NaHS處理有效降低了干旱脅迫下板栗幼苗細(xì)胞膜受損程度，提高了板栗的抗旱性[5]。本研究以H2S供體NaHS及H2S清除劑次?；撬?hypotaurine, HT)處理黃棚板栗當(dāng)年生實(shí)生幼苗，進(jìn)一步探討H2S對(duì)干旱脅迫下板栗幼苗根系抗氧化特性及呼吸相關(guān)酶活性的影響，以期闡明其調(diào)控植物抗旱性的生理生化機(jī)制，為進(jìn)一步探究H2S緩解板栗樹(shù)干旱脅迫的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試材料：黃棚板栗，由山東省果樹(shù)研究所萬(wàn)吉山試驗(yàn)基地提供。

試驗(yàn)于2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站進(jìn)行。選取飽滿(mǎn)且均勻一致的種子，5月20日播種于陶盆(高28 cm、直徑25 cm)內(nèi)，盆內(nèi)裝有酸洗潔凈的石英砂，基質(zhì)為草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1。播后澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，至7月中旬待植株長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的植株進(jìn)行處理。試驗(yàn)設(shè)置7個(gè)處理：1)對(duì)照(CK)：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；2)NaHS：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+0.5 mmol·L-1NaHS；3)PEG：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG；4)NaHS+PEG：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG+0.5 mmol·L-1NaHS；5)PEG+HT：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG+ 0.3 mmol·L-1HT；6)NaHS+PEG+HT：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+15% PEG+0.5 mmol·L-1NaHS+ 0.3 mmol·L-1HT；7)HT：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+0.3 mmol·L-1HT。每處理重復(fù)3次，每個(gè)處理100 mL。處理后24 h分別取樣，液氮速凍后-80℃保存，用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定；過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量采用硫酸鈦沉淀法[17]測(cè)定；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法[18]測(cè)定；脯氨酸(proline, pro)含量采用磺基水楊酸提取茚三酮顯色法[19]測(cè)定；蘋(píng)果酸脫氫酶(malic dehydrogenase, MDH)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G-6-PDH)活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS v7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；Microsoft Excel 2003作圖。結(jié)果均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下H2S對(duì)板栗幼苗根系抗氧化物酶活性的影響

正常生長(zhǎng)環(huán)境中，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；但在逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)生成大量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)降解、核酸損傷和酶失活，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而抑制植物生長(zhǎng)[20]。干旱脅迫下，植物體通過(guò)各種抗氧化劑及激活相關(guān)酶等應(yīng)激反應(yīng)來(lái)降低氧化毒性和維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡[21]。由圖1可知，正常生長(zhǎng)條件下，與CK相比，外源單獨(dú)NaHS處理均上調(diào)了板栗根系SOD、POD、CAT、APX活性，其中CAT活性顯著高于CK，單獨(dú)HT處理下，POD、APX活性顯著上調(diào)，SOD、CAT活性略高于CK，但差異不顯著。而15% PEG模擬干旱脅迫處理后，板栗根系SOD、POD、CAT、APX活性均顯著升高，分別較CK高70.04%、115.3%、164.9%、27.56%；與單獨(dú)PEG脅迫處理相比，外源NaHS處理后，SOD、POD、CAT、APX活性分別提高19.64%、24.67%、56.91%、16.29%，且差異顯著；PEG+HT處理下，APX活性顯著低于單獨(dú)PEG處理，SOD、CAT活性較PEG略有浮動(dòng)，但差異不顯著；PEG+NaHS+HT處理下的CAT活性顯著上調(diào)，其他3種酶活性與單獨(dú)PEG處理間均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，外源NaHS處理可以通過(guò)提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性來(lái)增強(qiáng)干旱脅迫下細(xì)胞對(duì)ROS的清除能力，而添加H2S清除劑HT可以逆轉(zhuǎn)上述效果。

注：不同小寫(xiě)字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as following.圖1 干旱脅迫下外源H2S對(duì)板栗幼苗根系SOD、POD、CAT、APX活性的影響Fig.1 Effect of exogenous H2S on the SOD,POD,CAT,APX activity in root of chestnut seedlings under drought stress

2.2 干旱脅迫下H2S對(duì)板栗幼苗根系MDA、H2O2含量的影響

植物遭受脅迫環(huán)境時(shí)，膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一的MDA大量生成[22]。MDA是反映膜系統(tǒng)受損程度和植物抗逆性的重要指標(biāo)。由圖2、圖3可知，在正常生長(zhǎng)條件下，與CK相比，單獨(dú)NaHS處理板栗根系MDA含量略有提高，H2O2含量則顯著降低；單獨(dú)HT處理下根系MDA、H2O2含量均高于CK，但差異不顯著。而單獨(dú)PEG脅迫處理下MDA、H2O2含量顯著升高，分別較CK高85.84%、31.79%。與單獨(dú)PEG處理相比，PEG+NaHS處理顯著降低了板栗根系MDA、H2O2含量，分別降低26.52%、20.86%；PEG+NaHS+HT處理下MDA含量顯著低于單獨(dú)PEG處理，降低了19.46%，H2O2含量略有下降，但差異不顯著；與單獨(dú)PEG處理相比，PEG+HT處理的根系MDA含量略有下降，而其H2O2含量則顯著下降。結(jié)果表明，外源H2S處理可以明顯緩解由于干旱造成的ROS過(guò)量積累，并降低細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化水平，緩解過(guò)氧化傷害，而添加HT處理則抑制了NaHS的效果，無(wú)法有效緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害。

圖2 干旱脅迫下外源H2S對(duì)板栗幼苗根系MDA含量的影響Fig.2 Effect of exogenous H2S on MDA content in root of chestnut seedlings under drought stress

圖3 干旱脅迫下外源H2S對(duì)板栗幼苗根系H2O2含量的影響Fig.3 Effect of exogenous H2S on the H2O2 content in root of chestnut seedlings under drought stress

2.3 干旱脅迫下H2S對(duì)板栗幼苗根系脯氨酸含量的影響

脯氨酸是逆境條件下植物體內(nèi)氮和能量的貯存庫(kù)，對(duì)降低細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的滲透勢(shì)、維持細(xì)胞內(nèi)酶正常結(jié)構(gòu)和構(gòu)象具有重要意義。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)積累大量脯氨酸，可以起到滲透調(diào)節(jié)的作用，防止細(xì)胞脫水[5]。由圖4可知，正常生長(zhǎng)條件下，與CK相比，單獨(dú)NaHS處理與HT處理的板栗根系脯氨酸含量分別提高7.7%、5.3%，但差異不顯著。單獨(dú)PEG脅迫處理下脯氨酸含量顯著升高，較CK增加了51.34%；與單獨(dú)PEG處理相比，PEG+NaHS處理下板栗根系脯氨酸含量顯著增加15.25%，PEG+NaHS+HT和PEG+HT處理均與單獨(dú)PEG處理間的脯氨酸含量無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，外源H2S處理顯著提高了干旱脅迫下板栗根系脯氨酸含量，而添加清除劑HT處理對(duì)脯氨酸含量變化無(wú)明顯效果。

圖4 干旱脅迫下外源H2S對(duì)板栗幼苗根系脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of exogenous H2S on the proline content in root of chestnut seedlings under drought stress

2.4 干旱脅迫下H2S對(duì)板栗根系MDH、PFK和G-6-PDH活性的影響

呼吸作用作為植物體內(nèi)主要的物質(zhì)和能量代謝途徑，是一切生命活動(dòng)的中心，同時(shí)呼吸作用的中間產(chǎn)物為植物體其他組織器官的形成提供重要的碳骨架[23]。MDH、PFK和G-6-PDH是調(diào)節(jié)各途徑呼吸速率的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響呼吸速率的強(qiáng)弱。由圖5可知，正常生長(zhǎng)條件下，與CK相比，單獨(dú)NaHS處理下MDH、PFK和G-6-PDH活性均略有提高，但不顯著，單獨(dú)HT處理對(duì)這3種酶活性無(wú)顯著影響。而單獨(dú)PEG脅迫處理下MDH、PFK和G-6-PDH活性均顯著下降，分別較CK低33.08%、39.43%、29.10%；添加NaHS處理較單獨(dú)PEG處理提高了板栗根系這3種酶活性，分別高27.28%、23.14%和15.36%，而PEG+NaHS+HT、PEG+HT處理下，除MDH活性顯著高于單獨(dú)PEG脅迫處理外，其他2種酶活性均無(wú)顯著變化。結(jié)果表明，外源H2S處理顯著提高了干旱脅迫下MDH、PFK和G-6-PDH活性，從而緩解了干旱脅迫對(duì)板栗幼苗根系呼吸代謝的影響，提升了板栗幼苗應(yīng)對(duì)干旱脅迫的能力，而添加抑制劑HT對(duì)酶活性變化無(wú)顯著影響。

圖5 干旱脅迫下H2S對(duì)板栗幼苗根系MDH、PFK和G-6-PDH活性的影響Fig.5 Effect of exogenous H2S on the MDH,PFK,and G-6-PDH activity in root of chestnut seedlings under drought stress

3 討論

3.1 H2S對(duì)干旱脅迫下板栗實(shí)生幼苗抗氧化特性的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物之一，H2O2是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，二者含量是反映膜系統(tǒng)受損程度和植物抗逆性的重要指標(biāo)。Zhang等[34]研究表明，H2S可有效減少大豆干旱脅迫下H2O2的累積；劉晶[15]等研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下水稻種子的MDA含量不斷增加，而PEG+NaHS處理下MDA含量顯著低于PEG。本研究中，干旱脅迫導(dǎo)致板栗幼苗根系MDA、H2O2含量均顯著升高，而添加NaHS處理顯著降低了根系中MDA、H2O2含量，表明添加外源NaHS可顯著降低由旱脅迫導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化水平，有效穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)板栗幼苗對(duì)干旱脅迫的抗性，而添加HT處理抑制了外源H2S緩解板栗幼苗根系MDA、H2O2含量升高的作用，無(wú)法有效緩解細(xì)胞膜脂過(guò)氧化傷害。

游離脯氨酸作為植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植株的代謝及生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。逆境脅迫下，細(xì)胞能主動(dòng)積累脯氨酸，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)，保護(hù)植物組織內(nèi)各種酶類(lèi)和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的正常功能[35]。與對(duì)照相比，干旱導(dǎo)致板栗幼苗根、葉的脯氨酸含量顯著增加。與單獨(dú)PEG脅迫處理相比，外源NaHS處理可以顯著增加干旱下板栗幼苗根系的脯氨酸含量，這與李永生[33]的研究結(jié)果一致。添加外源NaHS增大了細(xì)胞質(zhì)濃度，降低了滲透勢(shì)，使細(xì)胞在低滲透勢(shì)條件下仍能從胞外吸水，調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡，從而增強(qiáng)板栗的抗旱性；而添加清除劑HT對(duì)脯氨酸含量變化無(wú)明顯效果，與PEG處理差異不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明H2S在提高板栗抗旱性方面具有重要意義。干旱脅迫下，外源H2S啟動(dòng)相關(guān)生理響應(yīng)機(jī)制，調(diào)節(jié)板栗幼苗根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性從而有效緩解旱害，而其在分子水平上如何調(diào)控干旱脅迫下板栗幼苗的生理生化反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

3.2 H2S對(duì)干旱脅迫下板栗實(shí)生幼苗呼吸相關(guān)酶活性的影響

呼吸作用是維持植物新陳代謝和生長(zhǎng)及進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成與轉(zhuǎn)化最基本的力量源泉，呼吸代謝與植物的各種生理功能及形態(tài)建成如種子萌發(fā)、器官發(fā)育等密切相關(guān)[36]，其中植物根系的呼吸與植物物質(zhì)代謝和能量代謝密切相關(guān)，根系呼吸進(jìn)行順利與否是衡量植物根系功能和逆境脅迫的重要指標(biāo)之一[37]。植物體內(nèi)存在多條呼吸代謝途徑，包括糖酵解途徑(glycolysis, EMP)、三羧酸循環(huán)途徑(tricarboxylic acid cycle, TCA)、戊糖磷酸途徑(pentoso phosphate pathway, PPP)等，其中糖酵解途徑進(jìn)入三羧酸循環(huán)(EMP-TCA)途徑是細(xì)胞的核心代謝途徑，提供植物生長(zhǎng)發(fā)育物質(zhì)和能量，PPP可進(jìn)一步為合成代謝提供原料。研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，根系呼吸速率降低，呼吸代謝途徑發(fā)生改變[2]。逆境脅迫下，3種途徑交替運(yùn)行，從而維持植物正常的呼吸過(guò)程，保護(hù)植物免受外界傷害并提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。其中PFK可協(xié)調(diào)淀粉和磷酸丙糖的轉(zhuǎn)化，是調(diào)控EMP的關(guān)鍵酶[37]；MDH可催化L-蘋(píng)果酸形成生化反應(yīng)重要的中間產(chǎn)物草酰乙酸，是調(diào)控TCA的關(guān)鍵酶；G-6-PDH是調(diào)控PPP的關(guān)鍵酶，可催化PPP產(chǎn)生氨基酸、多糖、色素等多種中間產(chǎn)物，3種酶與呼吸速率密切相關(guān)，其活性高低直接影響呼吸速率的強(qiáng)弱[38]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫導(dǎo)致MDH、PFK和G-6-PDH活性均顯著下降，而添加NaHS處理下板栗根系3種酶活性分別較干旱脅迫高27.28%、23.14%和15.36%，在一定程度上緩解了根系的呼吸脅迫，減輕了干旱脅迫對(duì)板栗幼苗根系呼吸代謝途徑的抑制作用，提高了板栗幼苗對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力；而在干旱脅迫下進(jìn)行NaHS預(yù)處理的同時(shí)添加HT，則逆轉(zhuǎn)了上述緩解效用，進(jìn)一步說(shuō)明H2S參與干旱脅迫下植物呼吸代謝調(diào)控并發(fā)揮積極作用，而關(guān)于H2S對(duì)呼吸代謝的調(diào)控是通過(guò)激活內(nèi)源防御系統(tǒng)或通過(guò)與其他相關(guān)信號(hào)分子協(xié)作完成，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

干旱脅迫下0.5 mmol·L-1NaHS處理顯著提高了板栗幼苗根系抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX)和呼吸代謝相關(guān)酶(MDH、PFK、G-6-PDH)活性，以及根系脯氨酸含量，顯著降低了MDA、H2O2含量，減輕了干旱脅迫對(duì)植物造成的膜脂過(guò)氧化傷害及呼吸代謝的抑制，從而提高了板栗對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力，而添加H2S清除劑HT，則逆轉(zhuǎn)了上述緩解效果，表明H2S在提高植物抗旱性方面具有積極作用。