范廣宇, 唐 秀, 張?jiān)魄? 孟祥龍, 梁振綱

(1. 連云港海關(guān), 江蘇 連云港 222042; 2. 海南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心, 海南 ?？?570311)

隨著現(xiàn)代化學(xué)工業(yè)的發(fā)展,大量的農(nóng)藥被投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,為農(nóng)作物的產(chǎn)量提高發(fā)揮了巨大作用。但是,農(nóng)藥殘留污染也成為一個(gè)值得重視的問題。農(nóng)藥不僅可能殘留于農(nóng)產(chǎn)品中,同時(shí)也會(huì)進(jìn)入環(huán)境水體中。國內(nèi)外的一些研究[1-4]已經(jīng)發(fā)現(xiàn),多種除草劑和殺蟲劑在環(huán)境水體中均有檢出,如莠去津、西瑪津、撲草凈和毒死蜱等。這表明,在環(huán)境水體中除草劑和有機(jī)磷類殺蟲劑的殘留污染普遍存在,這些進(jìn)入環(huán)境水體中的農(nóng)藥會(huì)在水生動(dòng)物體內(nèi)殘留和富集。貝類一般捕食水體中的微小生物,極易富集海洋水體中殘留的農(nóng)藥[5],最終通過食物鏈影響到人類的健康。同時(shí),在近海養(yǎng)殖中,一些貝類養(yǎng)殖戶采用三唑磷等殺蟲劑作為清塘劑來殺死魚蝦、保護(hù)貝類種苗。海邊大量魚蝦死亡的報(bào)道時(shí)有發(fā)生[6]。因此,貝類中除草劑和有機(jī)磷類殺蟲劑等農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)較高,需要建立準(zhǔn)確快速的檢測方法監(jiān)控這些農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)。

目前,對于水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留采用的前處理方法主要有固相萃取法[7,8]、凝膠滲透色譜法[9-11]和QuEChERS法[12-14]等,檢測方法主要有氣相色譜法[7,8,15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[9,13,14,16,17]等。貝類中農(nóng)藥的檢測方法的報(bào)道主要集中在有機(jī)氯、多氯聯(lián)苯等,同時(shí)檢測貝類中除草劑和有機(jī)磷殺蟲劑的報(bào)道較少。QuEChERS法因?yàn)槠淇焖?、簡便、安全和成本低等而得?近幾年廣泛應(yīng)用到農(nóng)藥、獸藥等污染物的檢測中[18]。本研究基于QuEChERS法和高效液相色譜-質(zhì)譜,建立了一種同時(shí)檢測貝類中22種農(nóng)藥殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); Analyst工作站;XS 204分析天平(瑞士Mettler公司); A10 Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司); TDL-40B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); XW-80A型漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)。

西草凈(simetryn)、敵草凈(desmetryn)、撲滅通(prometon)、特丁通(terbumeton)、草凈津(cyanazine)、西瑪津(simazine)、環(huán)嗪酮(hexazinone)、莠滅凈(ametryn)、環(huán)丙津(cyprazine)、莠去津(atrazine)、吡唑草胺(metazachlor)、撲草凈(prometryn)、特丁凈(terbutryn)、撲滅津(propazine)、異丙凈(dipropetryn)、異戊乙凈(dimethametryn)、特丁津(terbuthylazine)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度>97%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,樂果(dimethoate)、三唑磷(triazophos)、對硫磷(parathion)、丙草胺(pretilachlor)、毒死蜱(chlorpyrifos)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)(美國Agilent公司);甲醇和乙腈均為色譜純(德國Merck公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸和乙酸為優(yōu)級(jí)純(中國國藥試劑公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。樣品購自本地市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解、定容,配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃儲(chǔ)存。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋,配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-18 ℃儲(chǔ)存。使用前用乙腈稀釋至所需濃度。

1.3 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品于50 mL離心管中。加入10 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈,渦旋混合30 s。加入1 g NaCl和4 g MgSO4,渦旋混合2 min。離心后取1 mL上清液,置于裝有50 mg PSA和20 mg GCB的試管中,渦旋混合1 min。以4 500 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜后,上機(jī)測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACE UltraCore 2.5 Super C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流動(dòng)相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～1 min, 10%B; 1～2 min, 10%B～40%B; 2～16 min, 40%B～95%B; 16～18 min, 95%B; 18～18.1 min, 95%B～10%B; 18.1～20 min, 10%B。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)源;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、正離子模式;實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?碰撞氣(CAD)壓力為41.4 kPa;氣簾氣(CUR)壓力為207 kPa;霧化氣(GS1)壓力為414 kPa;輔助氣(GS2)壓力為379 kPa;電噴霧電壓(IS)為5.5 kV;去溶劑溫度(TEM)為650 ℃;入口電壓(EP)為10 V;碰撞室出口電壓(CXP)為10 V。22種農(nóng)藥的保留時(shí)間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)見表1。

表 1 22種農(nóng)藥的保留時(shí)間、監(jiān)測離子對、碰撞電壓和去簇電壓

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制22種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/L),采用注射泵直接進(jìn)樣的方式注入質(zhì)譜儀。采用ESI+方式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,確定母離子[M+H]+,優(yōu)化DP。對母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,優(yōu)化CE,選擇兩個(gè)相對豐度較高且穩(wěn)定的特征碎片離子作為定量定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)化合物分別屬于三嗪類、酰胺類除草劑和有機(jī)磷類殺蟲劑,化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大,同時(shí)存在同分異構(gòu)體,對于色譜分離條件要求較高。本實(shí)驗(yàn)采用ACE UltraCore 2.5 SuperC18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離,梯度洗脫?？疾炝思状?0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)性時(shí),目標(biāo)化合物的分離效果和色譜峰形。結(jié)果表明,當(dāng)采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液時(shí),色譜峰分離效果不好,多個(gè)物質(zhì)同時(shí)段出峰;當(dāng)采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液時(shí),各物質(zhì)分離度較好;但采用前者時(shí)各物質(zhì)的峰高為后者的3倍,可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相含有酸時(shí)更有利于[M+H]+形成。因此本研究最終選擇甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離。

在優(yōu)化的條件下,22種農(nóng)藥的提取離子色譜圖見圖1。

圖 1 22種農(nóng)藥的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 22 pesticides

2.3 提取劑的優(yōu)化

提取方法參照QuEChERS法,分別研究了甲醇、乙腈、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈作為提取劑時(shí),各目標(biāo)物的提取效果。甲醇作提取劑時(shí)上清液渾濁,添加回收率均低于70%;而采用乙腈提取時(shí),回收率均可以達(dá)到70%～120%;含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈提取時(shí),與乙腈提取的回收率相當(dāng);但含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取液的峰形更好。因此選擇含0.1%(v/v)甲酸的乙腈作為提取溶劑。

圖 2 經(jīng)PSA和GCB凈化后22種農(nóng)藥的回收率分布Fig. 2 Recovery distribution of the 22 pesticides cleaned up by primary secondary amine (PSA) and graphitized carbon black (GCB)

2.4 凈化材料的優(yōu)化

QuEChERS法多采用PSA作為凈化材料,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)加入GCB,去除提取液的色素。分別對PSA和GCB的使用量進(jìn)行了優(yōu)化。在添加量為2 μg/kg時(shí),分別比較使用不同用量的PSA對目標(biāo)化合物回收率的影響,結(jié)果見圖2。不添加PSA凈化時(shí),目標(biāo)化合物回收率低于70%的偏多;而當(dāng)使用量為50 mg以上時(shí),所有化合物的回收率均在70%～120%之間?？赡苁荘SA用量少時(shí),存在的共萃取干擾物對目標(biāo)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生了影響。單獨(dú)用PSA凈化后的水產(chǎn)品樣品溶液呈黃色,為除去色素,加入GCB,考察其對目標(biāo)化合物回收率的影響。加入20 mg GCB凈化后,提取液變?yōu)榛緹o色透明的溶液,回收率也全部在70%～120%之間。同時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)GCB使用量超過30 mg后,多數(shù)農(nóng)藥回收率均有降低趨勢。因此,選擇采用50 mg PSA和20 mg GCB共同凈化提取液。

表 2 22種農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

為了考察基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects, ME)的影響,按照1.3節(jié)分別對文蛤、扇貝、赤貝和青蛤4種貝類樣品進(jìn)行前處理,配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈配制相同系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照下述公式進(jìn)行計(jì)算:ME=[(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100%。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng),20%≤|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng),|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[19]。弱基質(zhì)效應(yīng)可以忽略,而中等基質(zhì)效應(yīng)和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)則需采取基質(zhì)匹配校正曲線等方法消除。計(jì)算結(jié)果顯示,22種農(nóng)藥在4種貝類樣品中的|ME|均小于20%,所以本研究中直接采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 方法學(xué)評價(jià)

2.6.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

在優(yōu)化的條件下,配制22種農(nóng)藥質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、5、10、50和100 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各農(nóng)藥定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)見表2。22種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997。以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD),以S/N≥10確定方法的定量限(LOQ),結(jié)果見表2。

2.6.2精密度與回收率

采用空白文蛤樣品,分別在22種農(nóng)藥的定量限、2倍定量限和10倍定量限3個(gè)水平下進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。按照1.3節(jié)處理后,每個(gè)水平重復(fù)測定6次。方法的回收率和精密度結(jié)果見表3。3個(gè)添加水平下,22種農(nóng)藥的平均回收率為65.2%～109.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～15.2%(n=6)。

表 3 22種農(nóng)藥的回收率和精密度(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

將本方法應(yīng)用于20批樣品(其中文蛤8批、扇貝6批、赤貝4批和青蛤2批)的檢測,其中16批次有不同程度的檢出(>LOD)。毒死蜱、莠去津、撲草凈、三唑磷和西瑪津的檢出率較高,分別為70%、65%、65%、25%和25%,含量范圍分別為0.5～13.7、0.1～3.7、0.3～11.0, 0.5～2.5和0.3～0.8 μg/kg。從結(jié)果可以看出,貝類中這些農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)較高。但最新的國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[20]中還沒有對貝類中的這些農(nóng)藥殘留制定限量要求,國際食品法典委員會(huì)(CAC)、歐盟和美國等組織、國家和地區(qū)也沒有相關(guān)的限量要求,僅日本根據(jù)一律標(biāo)準(zhǔn)按照0.01 mg/kg的限量要求。因而需要更加全面地研究來評估潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測貝類樣品中22種農(nóng)藥殘留的分析方法。貝類樣品采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取,PSA和GCB凈化,然后采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測。將該方法應(yīng)用于貝類樣品檢測,檢出多種農(nóng)藥殘留。該方法樣品前處理簡單,分析速度快,精密度和靈敏度高,能夠同時(shí)測定水產(chǎn)品中22種農(nóng)藥殘留,對于貝類中農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評估有良好的應(yīng)用前景。