李雙青, 李曉敏, 張慶合

(中國計量科學(xué)研究院化學(xué)計量與分析科學(xué)研究所, 北京 100029)

真菌毒素是由絲狀真菌或者霉菌在適宜的條件下產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)多樣的小分子次級代謝產(chǎn)物[1,2],目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多種[3-5]。大多數(shù)的真菌毒素具有致畸性、肝毒性、腎毒性、致癌性、出血性、破壞免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等危害[3,6-9],可能污染農(nóng)產(chǎn)品及加工的農(nóng)副產(chǎn)品,攝入量超過一定限量后,可能危害人類及其他生物健康,甚至危害生命[10]。常見霉菌毒素有黃曲霉毒素(AFs: AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、赭曲霉毒素(OTA)、T-2毒素(T-2)等[1,11,12],性質(zhì)如表1所示[13,14]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)規(guī)定,AFs毒性最大,為1類致癌物質(zhì);OTA、FB1、FB2其次,為2B類致癌物;ZEN、DON、T-2為3類致癌物[15]。

表 1 常見真菌毒素的名稱、性質(zhì)以及來源

lgKow: oil-water partition coefficient.

使用機(jī)械壓榨或者有機(jī)溶劑提取等方法從油籽中獲得的植物油極易受到AFs、OTA、DON、ZEN等真菌毒素污染[6,16-22],全球每年約25%的糧油受到真菌毒素污染,造成數(shù)千億美元的經(jīng)濟(jì)損失[12],我國每年因真菌毒素污染造成的糧油損失累計約3 100萬噸[23]。油籽是植物油中真菌毒素產(chǎn)生以及傳播的理想媒介[20],環(huán)境的溫度和濕度、土壤類型、儲存運(yùn)輸條件等均會影響真菌毒素的污染[11]。在不同的種子以及環(huán)境中,真菌毒素的種類及含量不同[6],增加了真菌毒素檢測的難度。植物油中真菌毒素暴露已有不少報道[17]。有數(shù)據(jù)[24]表明,由真菌感染的儲存樣品中提取的油中顯示存在自然發(fā)生的AFs,杏油中AFB1的發(fā)生率較高,高達(dá)0.32 μg/g,在chironji和核桃油中高達(dá)0.28 μg/g,而在黃油中高達(dá)0.23 μg/g,樹油種子(TBOS)在真菌感染期間表現(xiàn)出顯著的油含量降低。德國市場上銷售的110種食用油樣品數(shù)據(jù)顯示,在大豆、向日葵和玉米胚芽的油中發(fā)現(xiàn)了鐮刀菌毒素,其中14種樣品中至少有一種毒素,在玉米胚芽油中發(fā)現(xiàn)高達(dá)1 730 μg/kg的ZEN[25]。而來自伊朗8個省份的97個植物油樣品數(shù)據(jù)顯示,約98%的采集樣本不含AFs,污染樣本中AFs的濃度均小于20 μg/kg,然而,健康風(fēng)險評估表明,Zanjan(贊詹省)的成人和兒童都患有相當(dāng)大的肝癌風(fēng)險(暴露邊界值MOE<100%的百分位數(shù)為95%)[26]。植物油中真菌毒素污染問題引起世界各國的廣泛關(guān)注,已然成為食品安全領(lǐng)域關(guān)注的焦點問題。

許多國家因此制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟委員會(EU)提出花生和其他油籽以及加工的產(chǎn)品中AFB1的限量為2.0 μg/kg, AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的總量不超過4.0 μg/kg;精制玉米油中ZEN限量標(biāo)準(zhǔn)為400 μg/kg[27]。美國食品藥品管理局(FDA)規(guī)定,人類食品中AFs含量不能超過20 ng/kg[28],而日本法規(guī)規(guī)定所有食品中AFs含量不得高于10 μg/kg,小麥及小麥制品中DON含量不得超過1 100 ng/kg[29]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定:植物油脂(除花生油、玉米油)中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg;花生油、玉米油中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/kg[30]。

真菌毒素種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,來源眾多,且植物油基體成分復(fù)雜,對前處理以及檢測技術(shù)提出了較高的要求。植物油基體中真菌毒素濃度低,油脂等干擾物影響分析,對儀器造成損害[31],檢測靈敏度以及準(zhǔn)確度降低。此外,經(jīng)典的檢測方法前處理步驟復(fù)雜,需要專業(yè)人士操作,耗時較長,成本較高,無法進(jìn)行大通量檢測,且真菌毒素確認(rèn)信息缺乏,定性能力不足[32,33]?？焖?、高通量檢測多種真菌毒素,提高提取效率以及減少目標(biāo)分析物的損失,成為檢測技術(shù)的重中之重,對植物油中真菌毒素的檢測技術(shù)提出巨大挑戰(zhàn)。本文綜合分析了近幾年來在植物油中真菌毒素檢測中樣品前處理方法和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 前處理技術(shù)

植物油基體成分復(fù)雜,其主要成分是脂質(zhì)、色素、不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸[16,34],脂質(zhì)會降低色譜柱的使用壽命,沉積在離子源上會產(chǎn)生離子抑制,降低分析的靈敏度,影響儀器的正常維護(hù)[35]。此外,油的黏度較大,不能用于直接進(jìn)樣,會發(fā)生堵塞,需要稀釋或者預(yù)先除油脂。因此,需選擇合適的前處理方法,有效清除植物油樣品中的干擾成分,減小基質(zhì)效應(yīng)和/或干擾。

真菌毒素檢測的前處理過程通常包括提取和凈化兩個步驟。常見的提取、凈化方法包括液液提取(LLE)、固相萃取(SPE)、凝膠滲透色譜(GPC)、固相微萃取(MSPE)、基質(zhì)固相分散萃取(MSPDE)、動態(tài)化學(xué)肼(DCHC)、QuEChERS等方法,其中LLE、SPE、GPC、DCHC、QuEChERS方法應(yīng)用較為廣泛。表2總結(jié)了近幾年來,應(yīng)用在植物油中的真菌毒素檢測的前處理方法。

1.1 LLE

LLE是真菌毒素檢測中應(yīng)用最為廣泛的提取方法,也是最簡單的前處理方法。提取過程中,植物油中的油脂等可能被同時萃取,產(chǎn)生基質(zhì)干擾,因此除去油脂成為關(guān)鍵的步驟。根據(jù)相似相溶原理,油脂易溶于石油醚、己烷和乙醚等非極性溶劑,難溶于水,而多數(shù)的真菌毒素不溶于石油醚、己烷和乙醚等非極性溶劑,但易溶于甲醇、乙腈等極性有機(jī)溶劑[58],當(dāng)提取劑中有水存在時,可增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力,提高萃取效率[59],因此常用提取劑為一定比例的乙腈/水溶液、甲醇/水溶液等,加入石油醚、己烷等有機(jī)溶劑,或低溫高速離心進(jìn)行脫除油脂處理。Giménez等[40]在乙腈/水溶液(84∶16, v/v)中加入正己烷脫除油脂,提取小麥胚芽油中的ZEN和DON。雖然ZEN微溶于己烷,但在己烷層中沒有明顯的損失,有效脫除了油脂,提高了靈敏度,回收率分別為104%和106%,檢出限分別為8和22 μg/kg。吳宇等[54]在乙腈/水中加入乙酸提取植物油中16種真菌毒素,16種真菌毒素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4,在4種不同植物油基體中加標(biāo)回收率為74%～106%, RSDs為0.3%～13.9%。同時,實驗發(fā)現(xiàn)直接提取低溫離心法有效去除了植物油基體的脂類雜質(zhì),背景干凈,凈化效果好,避免了Mycospin 400凈化填料吸附FB1、FB2、DON-3G的問題。在溶劑提取過程中,可使用超聲波輔助萃取、搖床提取或者加入冰醋酸等輔助方法提高提取效率[43]。朱建國等[31]對比高速均質(zhì)提取5 min、渦旋提取10 min、超聲提取20 min和搖床振蕩20 min 4種方式對AFs、ZEA、T-2、FB1等7種真菌毒素提取效率的影響,結(jié)果顯示,使用搖床振蕩方式提取效率最高,穩(wěn)定性好,回收率為76%～113%, RSDs為1.97%～4.22%。由于基體為植物油,提取溶劑易發(fā)生乳化現(xiàn)象,史俊文等[53]在甲醇的提取溶劑中加入一定量的NaCl,有效改善了乳化現(xiàn)象。Afzali等[44]提出免疫親和柱凈化與分散液液微萃取(DLLME)相結(jié)合的新方法,用于AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的預(yù)富集,回收率為96.0%～110.0%, RSDs小于7.8%。此方法克服了傳統(tǒng)的LLE存在有機(jī)溶劑消耗量大的缺點,簡單、快速、準(zhǔn)確性高、靈敏度高。

溶劑的選擇是決定LLE提取效率的關(guān)鍵,植物油中真菌毒素的提取溶劑一般選用甲醇或乙腈等極性有機(jī)溶劑或其中幾種的復(fù)合溶劑。在提取溶劑中加入石油醚、正己烷等去除植物油中油脂,在提取過程中輔以低溫離心、振蕩、渦旋等加強(qiáng)對油脂的去除,或加入冰醋酸、水、NaCl等改善因子,提高提取效率。但是,植物油基體復(fù)雜,在提取過程中油脂也可能同時被提取,產(chǎn)生基質(zhì)干擾,降低儀器靈敏度,需要進(jìn)行凈化步驟以減小或消除基質(zhì)干擾,并實現(xiàn)濃縮[60]。

1.2 SPE

SPE作為一種靈活的樣品制備方法,已被廣泛使用在植物油中真菌毒素凈化過程[61],其中免疫親和柱萃取(IAC)和多功能凈化柱萃取(MFC)應(yīng)用最為廣泛。

1.2.1IAC

免疫親和柱選擇性以及特異性強(qiáng),靈敏度高,方便快捷,但是價格昂貴。朱建國等[31]選擇CNBr-Activated Crystarose 4B作為載體,混合同步偶聯(lián)抗體,自制多組分免疫親和柱同步凈化植物油中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEA、T-2、FB1這7種真菌毒素,檢測效率高,檢測線性范圍廣,4種AFs的檢出限為0.02～0.08 μg/kg, ZEN、T-2、FB1的檢出限為0.10～0.50 μg/kg,滿足定量需求。吳振興等[51]使用Myco6in1TM真菌毒素免疫親和柱凈化,用LC-ESI-MS/MS檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN、DON、T-2和FB1,其定量限為0.2～1.0 μg/kg,回收率為73%～98%,方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。Ma等[52]通過將黃曲霉毒素的單克隆抗體1C11(MAb 1C11)共價偶聯(lián)至氨基硅膠微粒自制免疫親和柱,提取植物油中的AFs,回收率為94.1%～99.5%, RSDs為1.7%～3.1%。在植物油的色譜圖中未觀察到明顯的基質(zhì)干擾峰,表明基于氨基硅膠微粒的免疫親和柱可以有效去除植物油基體雜質(zhì)。曾曦等[56]建立了全自動在線免疫親和SPE-HPLC法,實現(xiàn)快速測定花生油基質(zhì)中的AFs,日間回收率為94.97%～104.02%,精密度為0.52%～3.67%。實驗對比了在線免疫親和柱萃取和離線萃取的效果,全自動在線SPE結(jié)果均在參考范圍內(nèi),并且測定AFs的結(jié)果均更接近給定的參考值。在線免疫親和萃取,減少了人為操作帶來的誤差,克服了傳統(tǒng)SPE柱只能單次使用的缺點,降低了時間和經(jīng)濟(jì)成本,增加了檢測的靈敏度以及準(zhǔn)確度。

IAC凈化程度高,靈敏度相對于MFC柱高,適用于復(fù)雜的基質(zhì),但是用于離線凈化的IAC柱價格昂貴,且不能重復(fù)使用。而在線免疫親和萃取則彌補(bǔ)了離線的IAC柱不可重復(fù)使用的缺點,提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度。目前,特異性免疫親和萃取材料的開發(fā)已成為一個大型且研究前景良好的領(lǐng)域[7], IAC柱從只能凈化一種或一類真菌毒素發(fā)展到可同時檢測多種真菌毒素,功能越來越強(qiáng)大,在多種真菌毒素檢測方面具有良好的發(fā)展前景。

1.2.2MFC

多功能凈化柱操作簡單,分析范圍廣,可同時進(jìn)行多組分凈化。常用的多功能凈化柱有MultiSep 226凈化柱、MycoSpin?400多毒素凈化柱、Oasis PRiME HLB小柱等。鮑蕾等[62]使用Mycosep#226凈化柱結(jié)合柱后電化學(xué)衍生HPLC,一步完成凈化過程,解決了AFB1、AFG1熒光弱的問題,回收率為85%～110%。許利麗等[41]使用多功能凈化柱-HPLC法檢測玉米油中DON, LC的基線平穩(wěn),回收率均在85%以上,凈化效果較好,比IAC柱成本低。

多功能柱保留干擾并以非常簡單的方式洗脫真菌毒素,無需活化或洗脫步驟,操作簡單、快速且質(zhì)量和性能匹配[40,41],適用于同時提取植物油中的多種真菌毒素。但對于多目標(biāo)分析,由于目標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)不盡相同,可能引起吸附劑對部分目標(biāo)物有一定的吸附作用,造成部分真菌毒素的回收率偏低[45],因此需要針對分析物性質(zhì)合理選擇MFC的類型。

1.2.3其他固相萃取方法

化學(xué)分析逐漸向著高效、環(huán)保的方向發(fā)展,隨著新型環(huán)保材料的開發(fā),新的SPE柱、新型磁性納米材料逐漸被開發(fā)設(shè)計,應(yīng)用到真菌毒素檢測中,不僅提高了提取效率,而且簡化了實驗程序,操作簡單,環(huán)境友好。

Zhou等[55]設(shè)計使用腐殖酸結(jié)合二氧化硅(HAS)作為SPE吸附劑(HAS-SPE)提取凈化AFs,價格低廉,環(huán)境友好。相比于MFC柱和IAC柱,HAS-SPE法直接稀釋凈化,在滿足AFs的高回收率和較好的凈化需求的同時,減少了溶劑使用量,簡化了實驗步驟。在HAS-SPE的最佳條件下,在混合油、茶油、菜籽油、花生油基質(zhì)中,4種AFs(B1、B2、G1、G2)的回收率為82%～106%。Zhao等[57]使用涂有雙層氧化硅的磁性納米顆粒(Fe3O4@nSiO2@mSiO2)對玉米油、菜籽油和豆油中的FB1、ZEN、OTA進(jìn)行凈化,3種物質(zhì)的回收率為89.4%～97.1%, RSDs為2.9%～5.7%。在凈化過程中僅需要施加外部磁場即可方便快速地將吸附劑與分析物從溶液中分離,再使用MeOH/ACN(50∶50, v/v)+1%(體積分?jǐn)?shù))HCOOH進(jìn)行洗脫,將3種真菌毒素富集,大大提高了檢測靈敏度,同時避免了SPE柱洗脫耗時問題和過濾操作。

吸附劑組合物影響選擇性和吸收性,是SPE的核心[63],包括離子交換、中空微纖維、C18材料和更有針對性的免疫吸附材料[7]。隨著新材料的發(fā)展,固相萃取的提取效率和提取速度得到很大改善,新的固相萃取材料可實現(xiàn)提取凈化為一體,操作簡單,環(huán)境友好,可大大提高凈化效率,節(jié)省時間與成本。此外,SPE可以實現(xiàn)在線固相萃取,大大減少時間,降低成本,減少人工操作帶來的偶然誤差,準(zhǔn)確度和靈敏度增加。

1.3 GPC

GPC是去除樣品中的色素、脂肪、蠟質(zhì)等大分子干擾物最有效的方法。王浩等[47]對GPC淋洗條件進(jìn)行優(yōu)化,使用乙酸乙酯/環(huán)己烷(1∶1, v/v)洗脫,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率均大于80%,線性系數(shù)在0.999 6以上,LODs為0.10～0.30 μg/kg, LOQs為0.3～1.0 μg/kg。宮小明等[45]使用GPC凈化時,采用分段收集組分進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測,保證了收集時間的準(zhǔn)確性。對比GPC凈化前后發(fā)現(xiàn)樣品的主要雜質(zhì)峰幾乎被完全去除,方法回收率為80%～96%。

GPC提供了一種從甘油三酯基質(zhì)中分離目標(biāo)化合物的簡單方法,已普遍應(yīng)用在富含脂肪、色素等大分子的樣品分離凈化方面,具有凈化容量大、可重復(fù)使用、適用范圍廣、自動化程度高等特點,具有明顯的凈化效果,非常適合糧油中真菌毒素的多組分殘留分析[48,55]。

1.4 DCHC

DCHC是以SPE柱為基礎(chǔ)的一種集提取凈化為一體的新方法,已在植物油中DON、ZEN的提取中應(yīng)用。Siegel等[37]使用DCHC法分離食用油中ZEN,檢出限和定量限分別為10和30 μg/kg,平均回收率為89%,與SPE、GPC或者IAC相比,樣品和有機(jī)溶劑的使用量少,凈化程度高,精密度高,特異性好,成本較低。DCHC技術(shù)可以實現(xiàn)在線固相萃取,大大縮短檢測時間,節(jié)省大量人力物力。Drzymala等[36]首次建立基于DCHC的全自動在線固相萃取-高效液相色譜法(online-SPE-HPLC)提取食用油中的ZEN, ZEN的平均回收率為78%, RSDs小于8%,滿足歐盟EC 401/2006要求。Online-SPE-HPLC沒有液液提取過程,直接用正庚烷將油樣稀釋上樣,縮短了分析時間,減少了溶劑使用量,并且DCHC可以重復(fù)使用多達(dá)15次性能不會降低。該方法與實驗采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法(IDMS)-LC-MS/MS方法相比,對于標(biāo)準(zhǔn)添加樣品定量效果相差不大,但是對于自然污染樣品的定量效果相比較差。

DCHC方法的特性和精確度優(yōu)于LLE或GPC,提取凈化植物油中的真菌毒素是DCHC的新應(yīng)用,雖然DCHC樣品制備時每次耦聯(lián)和解耦聯(lián)需要2 h,但步驟簡單。與LLE和GPC相比,具有最低的RSD,重復(fù)性好,非常適合作為定量儀器分析用途的樣品前處理方法,是LLE和GPC的替代方案[37]。

1.5 QuEChERS方法

QuEChERS方法是食品中痕量有機(jī)物檢測的新趨勢,比LLE和常規(guī)SPE更簡單,溶劑使用更少,提高了回收率,可針對多目標(biāo)真菌毒素同時提取[64],具有快速、簡單、便宜、效率高、安全、應(yīng)用范圍廣的特點,在真菌毒素的檢測中應(yīng)用廣泛。QuEChERS優(yōu)化主要從提取和凈化方面考慮,對于油基體提取一般選用乙腈作為提取劑,也可選用甲醇[4],必要時加入酸、可揮發(fā)性鹽等輔助試劑提高提取的效率。凈化是通過分散固相萃取(d-SPE)來除去干擾組分[64],可選用伯仲胺(PSA)、十八烷基(C18)、石墨化炭黑(GCB)、中性Al2O3和碳納米管(CNT)等吸附劑或其組合[61],也可輔以高速低溫離心去除油脂。Zhao等[16]使用QuEChERS技術(shù),對植物油中的16種真菌毒素進(jìn)行前處理,用LC-MS/MS進(jìn)行檢測。實驗優(yōu)化了提取劑,選用85%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈,并加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸,回收率明顯提高。用NaSO4和NaCl進(jìn)行鹽析,選用PSA、C18、GCB進(jìn)行凈化效果優(yōu)化,雖然在QuEChERS方法中PSA經(jīng)常被用來去除脂肪酸,但是實驗結(jié)果表明,選用C18做凈化劑,其對所有分析物的回收率最高,為77%～118%。而Sharmili等[4]在使用QuEChERS技術(shù)對植物油樣品進(jìn)行前處理時,用乙腈做提取劑,用MgSO4進(jìn)行鹽析,選用C18和GCB(3∶1, m/m)混合吸附劑,回收率為87.9%～106.6%,有明顯提高。同時,實驗對比了QuEChERS技術(shù)和IAC前處理技術(shù)對植物油AFs定量效果,結(jié)果表明,兩者定量效果相差不多,檢測濃度均在規(guī)定(2002/657/EC)范圍內(nèi),但是前者時間更短。因此QuEChERS作為一種新興技術(shù),在植物油中真菌毒素前處理過程中得到廣泛應(yīng)用。

提取和凈化是濃縮和分離真菌毒素必需的步驟,LLE和SPE是最為傳統(tǒng)、應(yīng)用廣泛的提取、凈化方法。但LLE存在有機(jī)溶劑消耗量大,價格昂貴,耗時較長的缺點[40,65],而SPE操作簡單,溶劑消耗少,提取時間非常短,可凈化預(yù)濃縮樣品,提高靈敏度[66],常將LLE和SPE結(jié)合對植物油中的真菌毒素進(jìn)行提取凈化。GPC可有效去除色素、脂肪等大分子干擾物,但是也存在昂貴的溶劑純化系統(tǒng)和大量有機(jī)溶劑的消耗問題[57,67]。DCHC、QuEChERS方法、磁性納米吸附材料是近幾年在植物油中真菌毒素分析中出現(xiàn)的方法,相比于廣泛使用的LLE、SPE、GPC,均具有提取效率高、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單、價格低廉的特點。磁性納米粒子選擇性高,操作簡單,價格低廉,可廣泛用于選擇性分離和預(yù)濃縮過程[57]。Fe3O4-MWCNT復(fù)合納米材料為吸附劑,采用改進(jìn)的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法已在真菌毒素檢測中應(yīng)用,表明QuEChERS方法和新磁性納米吸附材料的結(jié)合在植物油中真菌毒素的檢測中應(yīng)用將會更加廣泛[61]。

2 檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的檢測技術(shù)包括薄層色譜分析(TLC)法、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法、毛細(xì)管電泳(CE)法[68,69]、HPLC法、GC-MS/MS法、LC-MS/MS法等。其中,LC-MS/MS技術(shù)在植物油中真菌毒素的檢測中應(yīng)用最為廣泛。隨著化學(xué)與生物傳感器技術(shù)的發(fā)展,以傳感器為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)在真菌毒素的快速檢測中逐漸應(yīng)用。近幾年來,以GC、LC為基礎(chǔ)的儀器檢測技術(shù)在植物油中真菌毒素檢測的應(yīng)用如表2所示。

2.1 GC-MS/MS技術(shù)

GC常用于分析熱穩(wěn)定、易揮發(fā)性的化合物,而且需要進(jìn)行衍生化處理,但真菌毒素大部分是熱不穩(wěn)定的,故GC-MS/MS分析的真菌毒素種類有限,主要用來檢測單端孢霉烯族化合物,幾乎只局限于鐮刀菌毒素和棒曲霉素檢測[45,70-72]。Qian等[48]使用GPC提取植物油中的ZEN及其衍生物,用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC/EI-QqQ MS)檢測,使用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)用于補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng),為植物油中ZEN及其衍生物的測定提供準(zhǔn)確的結(jié)果。其方法凈化程度好,定量限為0.03～0.2 μg/kg,回收率為80%～97%,儀器檢測靈敏度高。

2.2 LC及LC-MS/MS技術(shù)

LC靈敏度高,準(zhǔn)確性好,穩(wěn)定性好,廣泛應(yīng)用于真菌毒素的定量。楊紅梅等[46]以流動相作為背景溶液,使用熒光檢測器考察了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在190～600 nm波長范圍內(nèi)的吸收與發(fā)射,選擇了360 nm為最佳激發(fā)波長,440 nm為最佳發(fā)射波長,樣品回收率均在82.6%～98.4%之間,RSDs為4.97%～9.79%,精密度高。

LC法通常對于同分異構(gòu)體和同系物的多組分析效果較差[71,72]。對無熒光或紫外吸收的真菌毒素需要進(jìn)行衍生化處理[73],而LC-MS/MS技術(shù)則無需衍生化,避免了衍生化帶來的影響,靈敏度提高[33]。LC-MS/MS技術(shù)選擇性好,靈敏度高,準(zhǔn)確性高,可用于多目標(biāo)真菌毒素分析檢測[71],成為目前定性、定量檢測的主要技術(shù)。

使用LC質(zhì)譜聯(lián)用檢測真菌毒素時,常用電噴霧電離(ESI)源、大氣壓化學(xué)電離(APCI)源和大氣壓光致電離(APPI)源[47]。由于真菌毒素種類繁多,相對分子質(zhì)量以及極性分布范圍廣,多數(shù)為熱不穩(wěn)定的物質(zhì),因此針對多種真菌毒素檢測時,最常用離子源為ESI,可在正負(fù)模式相互切換中實現(xiàn)目標(biāo)物的高效分離。

真菌毒素在ESI離子源的不同模式下產(chǎn)生不同的準(zhǔn)分子離子峰,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2等母離子在ESI+條件下一般以[M+H]+最優(yōu),而T-2、HT-2的母離子峰以[M+Na]+和[M+NH4]+最優(yōu),DON、ZEN在ESI-條件下以[M-H]-最優(yōu)[43]。對于多目標(biāo)物分析,需要ESI+和ESI-切換分析,其中流動相組成是影響其色譜行為以及離子化效率的關(guān)鍵因素,一般選用乙腈/水、甲醇/水作為流動相,或在流動相中加入弱酸、緩沖鹽或兩者的組合以提高靈敏度和分離效果。Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)使用乙腈/水作為流動相時,峰形較好,靈敏度高,檢出限為0.04～2.9 ng/g。而加入甲酸后,DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、β-ZAL以及β-ZOL的響應(yīng)受到明顯抑制。與甲酸銨相比,在乙腈/水的流動相中加入乙酸銨可獲得更高的響應(yīng),色譜的基線更加平滑。再以甲酸調(diào)節(jié)流動相pH值至3.5,得到較好的分離效果[51]。劉丹等[43]在ESI+模式下,在流動相中加入甲酸銨和甲酸,得到較高的離子化效率,解決了FB1和FB2無法出峰的問題;在ESI+模式下,在乙腈/水溶液中加入氨水,DON、ZEN等均獲得了較高的響應(yīng)和較好的峰形。

吳宇等[54]使用UPLC-MS/MS檢測植物油中16種真菌毒素,考察了其在Waters Cortecs C18(100 mm×2.1 mm, 1.6 μm)和菲羅門Kinetex F5(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)兩種色譜柱上的色譜分離情況。菲羅門Kinetex F5能夠?qū)崿F(xiàn)3-AcDON、15-AcDON、DON和DON-3G基線分離,峰形和分離度均不錯,解決了DON和DON-3G在質(zhì)譜上相互干擾的問題。采用IDMS對分析物進(jìn)行定量,加入全碳標(biāo)記的同位素內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。方法的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4,在4種不同植物油基質(zhì)中,16種真菌毒素在3個添加水平下的RSDs在0.3%～13.9%之間,獲得了很好的準(zhǔn)確度和精密度。

除流動相組成影響目標(biāo)物的離子化效率外,進(jìn)樣量也會影響質(zhì)譜峰響應(yīng),影響方法的靈敏度。Cavaliere等[38]選用20 μL的進(jìn)樣量,解決了大體積進(jìn)樣時的峰拖尾以及信號抑制問題,明顯提高檢測方法的靈敏度。

2.3 免疫分析技術(shù)

免疫分析是一種快速檢測技術(shù),操作相對簡單,靈敏度高,可在短時間內(nèi)對大量樣品進(jìn)行定量和定性篩選。免疫分析法主要有ELISA法、免疫過濾法、免疫層析法、熒光偏振免疫分析等[74]。ELISA法常應(yīng)用于真菌毒素的檢測,但是可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[3]。免疫層析色譜技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于真菌毒素檢測,其主要優(yōu)點是檢測快速(5～15 min),但不能進(jìn)行定量分析,只能用于初步篩選,證明濃度超過閾值的霉菌毒素存在[74]。隨著技術(shù)的發(fā)展,以免疫分析為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)正在向快速、便攜、易操作、現(xiàn)場檢測的方向發(fā)展[71]。

Yu[75]等提出了一種靈敏方便的電化學(xué)阻抗譜(EIS)方法,以MWCNTs/RTIL復(fù)合膜為基礎(chǔ)的免疫傳感器測定AFB1。AFB1檢出限為0.03 μg/L,檢出限低,靈敏度高,穩(wěn)定性好,適用性廣,能夠滿足快速、準(zhǔn)確檢測的需求,可用于植物油中真菌毒素的檢測。

近幾年來,化學(xué)生物傳感器技術(shù)被廣泛開發(fā),分子印跡聚合物(MIPs)也已經(jīng)在商業(yè)上有所應(yīng)用,在真菌毒素檢測方面,具有良好的發(fā)展前景[7]。

3 前景展望

植物油是人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?然而至今為止,植物油中真菌毒素的研究與其他基體中真菌毒素相關(guān)研究相比仍存在很大的差距,腰果油、棕櫚油、澳洲堅果油、馬魯拉油、松子油、蓖麻籽油、葡萄籽油等植物油的研究尚有很多空白[6]。油樣的基體較為復(fù)雜,黏度大,前處理必不可少,一些新型環(huán)保的納米材料、磁性材料應(yīng)用于前處理過程中,可實現(xiàn)簡單、高效提取和凈化,有望成為以后的發(fā)展方向。串聯(lián)質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜在真菌毒素檢測方面應(yīng)用越來越廣泛,使用LC-MS/MS技術(shù)有助于同時檢測多種真菌毒素,提高檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性,降低基體干擾,并且有助于規(guī)定一系列詳細(xì)準(zhǔn)確的限量標(biāo)準(zhǔn)。同時,開發(fā)快速、低成本、操作簡單的檢測技術(shù),也有助于實現(xiàn)快速檢測,甚至現(xiàn)場檢測市場售賣的糧油中的真菌毒素,有利于控制真菌毒素的污染與傳播,具有很好的發(fā)展前景。