陳 麗，付 丹，陳 霞

(四川省成都市第六人民醫(yī)院消化內科 610051)

據國家癌癥中心全國最新癌癥報告顯示，我國惡性腫瘤的發(fā)病率為278.07/10萬，病死率為167.89/10萬。其中，結直腸癌發(fā)病率已躍居惡性腫瘤第3位。截止2010年，我國結直腸癌新發(fā)病例數已超過27萬，死亡病例13萬以上,且有逐年增加的趨勢[1]。這主要與結直腸癌晚期的侵襲轉移密切相關。然而，目前對結直腸癌侵襲轉移的研究仍未找到可靠、敏感的判斷指標和治療靶點。

轉錄因子CP2(transcription factor CP2，TFCP2)最初被認為其與小鼠a球蛋白基因的啟動子區(qū)域相結合，通過增加TFCP2的表達后，激活a球蛋白的表達，可在體外誘導鼠白血病(MEL)細胞的分化[2]。近年來，TFCP2與腫瘤之間的關系得到越來越多研究者的報道。該轉錄因子在不同的腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)其扮演了不一樣的角色功能。有研究表明，TFCP2通過β-catenin/TCF 信號通路的激活，發(fā)揮癌基因的作用，可增加前列腺癌的侵襲轉移等惡性生物學行為[3]。而在惡性黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2扮演的是抑癌基因的功能，TFCP2的高表達可以抑制黑色素瘤細胞的生長[4]。此外，TFCP2還參與了腫瘤細胞上皮間質轉換，誘導腫瘤血管生成。與各種癌癥發(fā)生發(fā)展等密切相關，如肝癌、胰腺癌、透明細胞腎細胞癌、乳腺癌和甲狀腺癌等[2]。然而，TFCP2在結直腸癌中的表達情況及與結直腸癌的臨床病理參數之間是否存在一定的相關性，目前尚不清楚。本研究通過免疫組織化學、反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Western blot方法，在結直腸癌及癌旁結直腸黏膜組織中，對該基因做進一步深入研究。以期對臨床結直腸癌的風險評估和預后判斷提供有力的依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 臨床病理材料收集來自本院2011-2017年臨床結直腸癌手術送檢標本，共128例?；颊吣挲g33～82歲，中位年齡56歲，其中淋巴結轉移86例，無淋巴結轉移42例。癌旁結直腸黏膜組織均取自距腫瘤原發(fā)灶大于5 cm的切除腸管。Western blot、 RT-PCR檢測所采用的組織標本，均來自本院2017年結直腸癌手術切除的新鮮標本。本課題所有研究方法中的配對標本，采用的是同一患者手術切除的結直腸癌和其相對應的癌旁結直腸黏膜組織。

1.2方法

1.2.1主要試劑 一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗體購自美國Thermo Fisher公司，β-Tubulin抗體購自美國Santa Cruz公司。免疫組織化學染色SP檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒以及RT-PCR SYBR GreenⅠ檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司。蛋白提取試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)及免疫組織化學染色 用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，證實為結直腸癌的病理診斷。其后，采用免疫組織化學SP法染色，比較結直腸癌和癌旁結直腸黏膜組織中TFCP2的表達。主要步驟參考試劑盒說明書進行：脫蠟，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復，過氧化氫作用;正常山羊血清封閉；一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗體1∶200，4 ℃過夜;辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37 ℃作用1 h；辣根過氧化物酶作用30 min；DAB顯色，出現(xiàn)棕黃色著色后自來水沖洗終止反應；蘇木素復染細胞核。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，作為陰性對照。

1.2.3RT-PCR 提取結直腸癌和癌旁結直腸組織RNA(按照TaKaRa試劑說明進行)。測定標本濃度，PCR反應(TaKaRa逆轉錄試劑盒)10 μL體系按說明書進行,TFCP2引物序列按照參考文獻[4]設計，具體引物序列為：正向5′-TGG CTT CAA CAG TTC CCA TA-3′，反向5′-TCT GGC TGG TGG TTT GGT-3′。內參GAPDH引物序列為:正向5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC-3′，反向5′-ATG GAC TGT GGT CAT GAG TCC-3′。

1.2.4Western blot 配制10%分離膠，5%濃縮膠。依次加入Marker 5 μL(加拿大Fermentas公司)，待測樣品20 μL。半干法轉膜：采用聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Milliore公司)。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)漂洗印跡膜2次，放入5%蛋白封閉液(武漢博士徳)，室溫封閉4 h。一抗孵育：TFCP2按1∶1 000稀釋，內參Tubulin按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；二抗孵育，室溫作用2 h。ECL顯色：避光，在凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)中觀察、拍照。

1.3免疫組織化學染色結果判斷 顯微鏡下觀察每例標本免疫組織化學染色表達情況：TFCP2表達位于細胞核內，陽性染色為淺棕色至棕褐色。根據參考文獻[5]方法評估染色結果，采用染色百分比評分與染色強度評分相結合方法。染色百分比評分：沒有陽性信號為0分，1%～10%細胞著色計為1分，11%～50%的細胞著色計為2分，51%～80%細胞著色計為3分，大于80%細胞著色計為4分。染色強度評分標準：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分。最后將染色陽性百分比得分與染色強度得分結果相乘，總分為0～12分，總分小于或等于6分設為陰性，大于6分設為陽性。病理閱片由2位有經驗的病理醫(yī)師雙盲評分。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計學分析，比較結直腸癌與癌旁結直腸黏膜組織間以及腫瘤不同臨床病理參數間TFCP2表達陽性率差異采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TFCP2的表達 免疫組織化學染色顯示結直腸癌組織及癌旁結直腸黏膜組織中TFCP2的表達情況，TFCP2蛋白主要位于細胞核內，在不同TNM分期的結直腸癌中其表達具有異質性，見圖1。TFCP2的表達在低分化的結直腸癌組織的表達強于高、中分化的結直腸癌組織。統(tǒng)計結果顯示，128例的結直腸癌及癌旁結直腸黏膜組織中TFCP2的陽性表達率分別為86%和21%。

A：癌旁結直腸黏膜組織；B：高、中分化結直腸癌組織；C：低分化結直腸癌組織

圖1TFCP2在癌旁結直腸黏膜及癌組織中的表達(免疫組織化學×200)

2.2RT-PCR結果 5例配對標本中，結直腸癌組織TFCP2 mRNA的表達水平顯著高于癌旁結直腸黏膜組織，前者是后者的1.40～17.00倍。見圖2。

2.3Western blot結果 TFCP2在結直腸癌組織的表達量是對應癌旁結直腸黏膜組織中的1.01～3.56倍。見圖3。

2.4TFCP2的表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性 128例的結直腸癌標本按照臨床病理特征分組，TFCP2的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤大小等無顯著相關性，與浸潤深度、分化程度、Dukes′分期和淋巴結轉移等具有顯著相關性(表1)。結直腸癌組織中TFCP2的表達為陰性和陽性分別為18/128(14.1%)和110/128(85.9%)，而癌旁結直腸黏膜組織中TFCP2的陰性表達和陽性表達分別為101/128(78.9%)和27/128(21.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 結直腸癌及癌旁結直腸黏膜組織中TFCP2 mRNA的表達水平

圖3 TFCP2在結直腸癌腫瘤標本及癌旁結直腸黏膜組織中的蛋白表達水平

3 討 論

TFCP2的DNA結合域有一個特點，它類似免疫蛋白的結構，與腫瘤抑制基因TP53相類似，因此其被認為很可能是p53基因的前體[6]。TFCP2也被認為可能扮演了抑癌基因的功能。然而，隨著研究者不斷地研究發(fā)現(xiàn)，TFCP2在不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮了不同作用。一方面發(fā)揮了促癌的作用，例如，在對肝細胞性肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在超過90%的肝細胞性肝癌標本，相對于正常肝組織，TFCP2是呈高表達的，它的表達水平與肝細胞性肝癌的進展密切相關[7]。在對口腔鱗狀細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2在腫瘤細胞的表達是顯著增強的，它與腫瘤TNM分期相關[8]。在對宮頸癌、卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)TFCP2的表達和腫瘤的進展密切相關[9-10]。β-catenin/TCF信號通路在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了極其重要的作用[11]。有研究者在對胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2可以激活β-catenin/TCF信號通路，從而促進了胰腺癌的侵襲轉移[3]。然而β-catenin/TCF這條通路同樣在結直腸癌的侵襲、轉移中發(fā)揮了關鍵的作用[12]。因此，TFCP2在結直腸癌的侵襲、轉移中是否發(fā)揮此作用還有待進一步研究。另一方面，有研究者在對惡性黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，TFCP2在惡性黑素瘤腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了抑癌基因的功能。TFCP2的過度表達抑制了惡性黑色素瘤細胞的生長。TFCP2與死亡相關的蛋白激酶(DAPK)基因啟動子區(qū)結合，正向調節(jié)其轉錄。DAPK在許多腫瘤中被證實其發(fā)揮的是抑制腫瘤細胞功能。因此，有研究表明，在某些情況下TFCP2可以起到抑制腫瘤的作用[4]。

然而，本研究結果表明，TFCP2的表達與腫瘤患者發(fā)生的年齡、性別腫瘤的部位及大小無關，與腫瘤的分化、浸潤深度、侵襲轉移、Dukes′分期等密切相關。通過RT-PCR及Western blot進一步證實TFCP2在結直腸癌組織的表達是顯著高于癌旁結直腸組織，說明其高表達可能參與了腫瘤的發(fā)生和進展。但其與患者預后之間的關系，尚有待以后的隨訪資料來加以明確。結直腸癌發(fā)生的具體原因及機制尚未闡明，目前，研究者們更接受FEARON等[13]的大腸癌發(fā)生的經典模式，該模式認為腫瘤的發(fā)生可能是個復雜的過程，涉及多基因改變從而導致結直腸癌的發(fā)生，包括腺瘤性結腸息肉(APC)病基因，微衛(wèi)星不穩(wěn)定，p53基因的突變與缺失等。TFCP2基因曾被認為是TP53的前體基因，TFCP2基因與TP53基因在結直腸癌中的發(fā)生過程中是否有著內在的聯(lián)系，尚有待進一步研究。本研究結果表明，TFCP2在結直腸癌組織中高表達，并且在淋巴結轉移的病理標本中顯著高表達，這提示TFCP2可能在結直腸癌的發(fā)展演進過程中發(fā)揮重要的作用，可能扮演了促癌的角色。其具體機制有待于進一步的研究證實。

綜上所述，TFCP2的表達與結直腸癌分化、Dukes′分期以及侵襲轉移存在顯著相關性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的促癌作用。在臨床標本中常規(guī)檢測TFCP2的表達對于疾病的轉移風險評估和預后判斷有重要的提示作用。同時，通過對TFCP2的分子調控機制研究，可能對結直腸癌有重要的科研和臨床指導價值。