李 敏,陶 陶,張繼榮

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)/貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,貴陽 550001；2.貴州省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,貴陽 550001)

腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷是一種病理生理復(fù)雜的過程，CIR后的致病機(jī)制可能與能力衰竭、細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高、興奮神經(jīng)遞質(zhì)釋放、氧化應(yīng)激、炎癥等有關(guān)。上述機(jī)制既相互作用又相互影響，進(jìn)而促進(jìn)缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷后梗死灶的形成，神經(jīng)功能的缺失。腦組織損傷后神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為壞死和凋亡，凋亡是I/R損傷最重要的形式。豐富環(huán)境是一種新奇的康復(fù)訓(xùn)練方式，已被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，例如，腦卒中動(dòng)物神經(jīng)功能康復(fù)訓(xùn)練，并且取得良好的訓(xùn)練效果，但是豐富環(huán)境如何使神經(jīng)功能得以康復(fù)的機(jī)制卻少有研究。近期研究發(fā)現(xiàn)，豐富環(huán)境能使腦卒中大鼠神經(jīng)功能得以恢復(fù)，考慮與神經(jīng)元發(fā)生凋亡有關(guān)；豐富環(huán)境可使相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)，使得凋亡減少，從而神經(jīng)功能得以恢復(fù)[1-2]。P53是目前公認(rèn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，其在腦缺血中的表達(dá)調(diào)控已成為目前缺血神經(jīng)元死亡機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究對(duì)豐富環(huán)境下大鼠CIR損傷后缺血半暗帶區(qū)P53蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質(zhì)量250～280 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)批號(hào)：SCXK(黔)2016-0001。動(dòng)物使用符合貴州省動(dòng)物管理委員會(huì)管理?xiàng)l例。將大鼠分為假手術(shù)組(n=20)、標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組(n=20)、豐富環(huán)境模型組(n=20)。

1.1.2主要試劑 直徑18～20 mm的尼龍線栓(北京西濃科技)，Solarbio蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(索來寶公司)，Antin-P53抗體(武漢三鷹)，羅丹明(Rhodamine)標(biāo)記山抗大鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，免疫熒光試劑盒，TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)。rat p53 F-GGC TCC GAC TAT ACC ACT ATC CAC TAC，rat p53 R-TTC TTC CTC TGT CCG ACG GTC TC，rat actin F-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA，rat actin R-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(發(fā)光)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水。

1.2方法

1.2.1造模 參照Longa法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注損傷模型，具體操作如下：腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位，取頸部正中切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、右側(cè)頸外動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈起始處放置小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉血流，在頸總動(dòng)脈剪一小口插入線栓，放開動(dòng)脈夾將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔插入(插入深度自頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約18 cm)，缺血90 min后，再次麻醉大鼠，拔出線栓，縫合頸部切口，即完成大鼠缺血90 min再灌注損傷模型。大鼠蘇醒后觀察其步態(tài)和行為，以判斷模型是否制備成功。假手術(shù)組線栓不插入大腦中動(dòng)脈，其余操作與模型組相同。

1.2.2環(huán)境設(shè)置 標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：每只籠子(45 cm×30 cm×20 cm)飼養(yǎng)3只大鼠，予以正常飲食，無玩具飾品等。豐富環(huán)境：大小為150 cm×120 cm×80 cm，鐵鏈和秋千懸于籠中，各種小木塊及各種帶有顏色的小玩具每周更換1次。同時(shí)給予聲音及晝夜交替光照刺激。

1.2.3改良神經(jīng)功能缺失(modified neurological deficit score，mNSS)評(píng)分 分別在1、28 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分，總分為0～18分，分級(jí)如下：0～6分為輕度損傷；7～12分為中度損傷；13～18分為嚴(yán)重?fù)p傷。分?jǐn)?shù)越高表明行為缺陷更嚴(yán)重。

1.2.4石蠟切片制備 將假手術(shù)組、標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組、豐富環(huán)境模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后，4%多聚甲醛灌注后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，然后梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。

1.2.5HE染色 取各組各時(shí)間點(diǎn)石蠟切片，按照Solarbio HE染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.2.6免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)中P53蛋白表達(dá) 取各組各時(shí)間點(diǎn)石蠟切片常規(guī)梯度乙醇脫水，0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，每次5 min，檸檬酸鹽緩沖液煮沸，將各組各時(shí)間點(diǎn)石蠟切片放入其中，微波爐中高溫加熱20 min，牛血清清蛋白(BSA)封閉液，37 ℃封閉30 min。每張切片滴加一抗(1∶150)，濕盒4 ℃避光孵育過夜，次日取出切片，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，每次5 min，滴加藍(lán)色熒光二抗，濕盒內(nèi)避光孵育1 h，滴加抗熒光猝滅劑，蓋玻片封片，立即置于熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)缺血側(cè)梗死灶周邊缺血半暗帶區(qū)200倍視野下熒光陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片取3個(gè)互不重疊部位，每份標(biāo)本取3張切片，用Image J軟件分析。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)P53 mRNA表達(dá) 在各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠麻醉后斷頭取腦，冰面上快速分離出梗死側(cè)大腦半球，進(jìn)行樣品制備，用Trizol法提取RNA，測(cè)量RNA純度，純度在1.8～2.1即可使用，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取得各組各時(shí)間點(diǎn)cDNA，按照50 μL反應(yīng)體系分別加入反應(yīng)混合物(ROX)、前后引物序列、DEPC水、cDNA。設(shè)置反應(yīng)qPCR儀反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 15 min；變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 15 s，延伸 72 ℃ 20 s,循環(huán)40次；溶解曲線階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。相對(duì)基因表達(dá)水平為根據(jù)ΔCt(ΔΔCt)方法計(jì)算如下：目標(biāo)量=2-ΔΔCt。

2 結(jié) 果

2.1mNSS評(píng)分結(jié)果 假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分均為0分。在第1天時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組與豐富環(huán)境模型組評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在第28天時(shí)，豐富環(huán)境模型組評(píng)分(8.00±1.10)分比標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組(9.83±1.17)分降低(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.05，與豐富環(huán)境模型組比

圖1mNSS評(píng)分結(jié)果

2.2HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下見假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組大鼠見其梗死側(cè)腦組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)呈三角形或扇形，軸突缺失，胞核固縮，核仁消失。梗死中心區(qū)神經(jīng)元脫失，殘存細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整；缺血半暗帶以神經(jīng)元固縮為主，未見明顯的神經(jīng)元脫失。豐富環(huán)境模型組在CIR 28 d后神經(jīng)元病理學(xué)改變明顯減輕，缺血半暗帶神經(jīng)元脫失減輕，周邊皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)趨于正常。見圖2。

圖2 各組28 d時(shí)HE染色病理切片(×200)

2.3免疫熒光標(biāo)記法測(cè)量缺血半暗帶區(qū)P53蛋白表達(dá)結(jié)果 假手術(shù)組大鼠右側(cè)腦組織皮紋下紋狀區(qū)見極弱P53蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞。再灌注第1天時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組缺血側(cè)腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)出現(xiàn)大量P53陽性細(xì)胞，豐富環(huán)境模型組同上述表現(xiàn)。再灌注第28天時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組(157.42±0.37)缺血側(cè)腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)仍有大量P53陽性細(xì)胞，但豐富環(huán)境模型組(129.43±0.42)缺血側(cè)腦組織梗死灶周邊半暗帶區(qū)P53陽性細(xì)胞明顯減少。見圖3。

2.4qPCR檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)P53 mRNA表達(dá) 假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)P53 mRNA呈極弱表達(dá)。再灌注第1天時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組及豐富環(huán)境模型組P53 mRNA表達(dá)迅速增加；兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；再灌注第28天時(shí)，豐富環(huán)境模型組P53 mRNA表達(dá)(2.11±0.04)較第1天時(shí)明顯下降，但標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組(2.36±0.12)較第1天時(shí)未見明顯降低，與豐富環(huán)境模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4、5。

圖3 各組各時(shí)間點(diǎn)P53蛋白陽性細(xì)胞(免疫熒光標(biāo)記法×200)

A:actin mRNA溶解曲線圖；B：p53 mRNA溶解曲線圖

圖4各組各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)actinmRNA、P53mRNA

a：P<0.01，與豐富環(huán)境模型組比

圖5各組各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)P53mRNA表達(dá)比較

3 討 論

豐富環(huán)境已經(jīng)在大量動(dòng)物模型中顯示了對(duì)大腦發(fā)育和損傷的恢復(fù)有好處。與動(dòng)物研究中的其他康復(fù)技術(shù)(如約束和特殊肢體訓(xùn)練)不同，豐富環(huán)境不同的應(yīng)用，在于它有利于實(shí)驗(yàn)者能夠自愿參與周圍環(huán)境中，且能被無挑戰(zhàn)性活動(dòng)刺激[3]。大部分研究報(bào)告將豐富環(huán)境應(yīng)用于卒中后的動(dòng)物，對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力有增強(qiáng)的功效[4]。在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，處于豐富環(huán)境模型組的大鼠，其神經(jīng)功能缺損改善情況明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境模型組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述大部分研究報(bào)告結(jié)果交相呼應(yīng)。越來越多實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，豐富環(huán)境對(duì)腦損傷有著神經(jīng)保護(hù)作用和改善神經(jīng)功能作用，其作用是通過誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生、增加樹突分枝和脊柱密度、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)因素的產(chǎn)生和基因表達(dá)的變化發(fā)揮的[5-9]。CHEN等[1]通過建立中腦動(dòng)物閉塞(MCAO)模型調(diào)查豐富環(huán)境治療對(duì)CIR損傷后周圍皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響，顯示豐富環(huán)境能改善大鼠神經(jīng)功能，減少大鼠腦組織梗死灶體積，提高神經(jīng)元存活率，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，增加Bcl-2蛋白水平，降低Bax、細(xì)胞色素C、Caspase-3表達(dá)。推測(cè)豐富環(huán)境治療可介導(dǎo)線粒體損傷途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。

P53是目前公認(rèn)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子。P53促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制主要以轉(zhuǎn)錄非依賴信號(hào)途徑為主，而非依賴信號(hào)途徑最主要的是線粒體途徑。在細(xì)胞質(zhì)中的P53轉(zhuǎn)錄非依賴活性是通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl或激發(fā)促凋亡蛋白Bax引發(fā)細(xì)胞凋亡。這個(gè)機(jī)制正好與CHEN等[1]的研究相似。P53在腦缺血中的表達(dá)調(diào)控已成為目前缺血神經(jīng)元死亡機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。去除P53基因的腦缺血大鼠，神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了P53蛋白在調(diào)控腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要作用[10]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的CIR動(dòng)物模型中P53的表達(dá)受到抑制，從而發(fā)揮其腦神經(jīng)保護(hù)作用[11]。徐堅(jiān)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，天麻及電針治療能夠抑制或延遲P53蛋白的表達(dá)途徑，使缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡降低，以便改善局部缺血缺氧、改善微循環(huán)，使腦I/R損傷程度降低。在本實(shí)驗(yàn)mNSS評(píng)分結(jié)果得出，豐富環(huán)境可以改善I/R損傷后大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀。通過免疫熒光及qPCR結(jié)果可以看出，豐富環(huán)境可使缺血半暗帶區(qū)P53表達(dá)下降，與徐堅(jiān)等[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理、電針均屬于康復(fù)方式，豐富環(huán)境也是一種新興的康復(fù)訓(xùn)練方式，積極康復(fù)訓(xùn)練均可使I/R損傷大鼠神經(jīng)功能得到改善。從微觀促凋亡因子P53表達(dá)到大鼠神經(jīng)功能改善情況，可以大膽推測(cè)，I/R損傷后大鼠神經(jīng)功能改善可能與豐富環(huán)境干預(yù)大腦缺血半暗帶區(qū)促凋亡因子P53表達(dá)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)探討豐富環(huán)境對(duì)SD雄性大鼠CIR損傷后的神經(jīng)功能缺失癥狀、腦組織內(nèi)P53表達(dá)隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)的變化，結(jié)果顯示豐富環(huán)境對(duì)腦組織低氧應(yīng)答起保護(hù)作用，為臨床上應(yīng)用豐富環(huán)境治療缺血性腦卒中提供了理論依據(jù)。