胡一梅，葛一漫，雍江堰，王 毅

(1.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610037;2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，成都 610075；3.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，成都 610037)

急性濕疹是臨床上常見的炎性皮膚疾病，該病發(fā)病機制復雜，目前與皮膚屏障功能障礙相關的研究為主要方向之一[1-2]。皮膚屏障發(fā)揮正常的防御功能，以及保持表皮水分和電解質作用需要依靠角質層的完整，即“磚-墻結構”的完整。角質細胞作為“磚頭”構成支架結構，細胞間脂質作為“泥漿”用來黏合穩(wěn)固“磚頭”。以上任一結構發(fā)生變化可能導致皮膚屏障異常，從而誘發(fā)急性濕疹。

本實驗擬通過運用馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠模型進行干預治療，結合局部皮損處經(jīng)皮水分丟失量(transepidermal water loss，TEWL)、蛋白酶激活受體2(protease activated receptor-2，PAR-2)及人類中間絲聚合蛋白(filaggrin，F(xiàn)LG)的表達，探討馬齒莧對皮膚屏障的調控作用及其在急性濕疹發(fā)生發(fā)展中起到的主要作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 體質量180～220 g的清潔級大鼠[成都達碩生物科技有限公司，許可證號:SCXK(111)2008-24]30只，雌雄不限。

1.1.2藥物與試劑 馬齒莧提取液(去根的新鮮馬齒莧鮮榨提取獲得)。二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene，DNCB；成都科龍化工試劑廠，批號：20090813)。

1.1.3儀器 AF200皮膚表皮水分喪失測定儀( 英國BIOX公司)；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；Image-Pro Plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)(福建省麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及造模 實驗第1天首次致敏于大鼠腹部皮膚涂抹5% DNCB 30 μL，2 d后進行2次激發(fā)，在大鼠右背部皮膚涂抹0.2% DNCB 50 μL，連續(xù)攻擊3次，每3天1次。第9天將20只造模大鼠平均分為模型組和馬齒莧組。另有不作處理的10只大鼠為正常組。第10天馬齒莧組大鼠給予馬齒莧藥物進行治療，連續(xù)9 d。

1.2.2實驗取材 末次給藥后，斷頸處死大鼠，取大鼠皮損組織2塊，一塊固定于10%中性甲醛中48 h；另一塊置于-80 ℃液氮中速凍，待測。

1.2.3觀察指標 (1)表皮TEWL值測定：采用皮膚表皮水分喪失測定儀測定各組大鼠TEWL值。(2)各組大鼠皮膚PAR-2及其水平的測定：將上述各組大鼠右背部皮膚包埋的蠟塊切成4 μm厚的組織切片，按照免疫組織化學試劑盒說明書進行PAR-2免疫組織化學染色，同時設置陽性和陰性對照。一抗PAR-2購自北京博奧森生物技術有限公司，克隆號：bs-1178R。二抗及相應試劑盒及陽性片購自北京中山金橋生物有限公司。染色后封片，顯微鏡下觀察，圖像分析系統(tǒng)計算PAR-2的積分光密度。(3)RT-PCR檢測大鼠皮膚FLG基因的表達：用Trizol法提取急性濕疹大鼠皮膚組織中的總RNA，并鑒定檢測樣品純度。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書進行操作，使用System SDS Software軟件計算循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)，采用β-actin作為內參照基因，以2-△△Ct作為Filaggrin基因的表達水平。Filaggrin引物序列，上游5′-AGG AGC GAG ACC ATC AGC-3′；下游5′-GCA CCT TGC CAC TCT GTT-3′。β-actin引物序列，上游5′-TCT AGG CAC GTG GCA AGG GTG TG-3′；下游5′-TCA TGA GGT AGT TGC CGT CAG G-3′。

2 結 果

2.1各組大鼠大體外觀比較 正常組大鼠皮膚光滑無異常，模型組大鼠右背部造模區(qū)皮膚出現(xiàn)肉眼可見紅腫、丘疹、水皰、糜爛和滲出等急性濕疹癥狀。馬齒莧組大鼠用藥后，造模區(qū)皮膚紅腫、糜爛和滲出等皮損程度降低，丘疹和水皰消散，皮膚變得光滑。見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚臨床表現(xiàn)

2.2各組TEWL的檢測結果 用藥后，正常組大鼠TEWL水平為(2.35±0.18)g·h-1·m-2，模型組為(11.36±1.66)g·h-1·m-2，馬齒莧組為(3.25±0.47)g·h-1·m-2，與模型組比，馬齒莧組大鼠TEWL水平顯著降低(P<0.05)，但高于正常組(P<0.05)。

2.3各組大鼠皮膚組織PAR-2檢測結果 鏡下可見PAR-2陽性物質呈棕黃色、黃色、淺黃色顆粒狀，位于皮膚表皮棘細胞、皮膚附屬器汗腺細胞、皮脂腺細胞、毛囊細胞、真皮內炎細胞胞漿，部分位于真皮內間質組織中。用藥后，馬齒莧組PAR-2陽性物質染色變淺、分布面積減少(圖2)。用藥后，正常組大鼠PAR-2水平為(0.153 4±0.002 2)μm2，模型組為(0.170 8±0.011 5)μm2，馬齒莧組為(0.154 1±0.006 8)μm2，與模型組相比，馬齒莧組PAR-2水平明顯降低(P<0.05)，但略高于正常組(P>0.05)。

2.4各組大鼠皮膚FLG的檢測結果 正常組大鼠FLG基因表達為(6.20±0.68)，模型組為(0.79±0.19)，馬齒莧組為(4.34±1.21)。與模型組比，馬齒莧組大鼠FLG基因的表達顯著增高(P<0.05)，但低于正常組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠皮膚組織中PAR-2的表達(免疫組織化學染色×200)

3 討 論

外界過敏性物質對皮膚屏障的破壞是急性濕疹疾病發(fā)生、發(fā)展的誘因之一。由于皮膚屏障功能的異常表達，使過敏原從外環(huán)境滲透到皮膚，導致急性濕疹發(fā)生并進一步惡化[3]。馬齒莧主要含有生物堿類、萜類、香豆素類、黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油及多糖等化學成分，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力的作用，在臨床上主要用于治療濕疹、炎癥、瘙癢癥和糖尿病等疾病[4]。作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧能夠明顯改善DNCB所致的大鼠急性濕疹癥狀[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，皮膚屏障功能的優(yōu)劣與代表角質層水分流失量的TEWL呈負相關關系，TEWL越高，表示角質層含水量越少，皮膚屏障功能損傷越嚴重[7]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，急性濕疹大鼠TEWL明顯增高，這與SIMPSON等[8]研究結果一致，馬齒莧組TEWL比模型組顯著降低。結果提示，馬齒莧可能是通過減少TEWL，增加角質層水分含量，修復受損的皮膚屏障，達到治療急性濕疹的作用。

急性濕疹發(fā)生時，皮膚代謝功能異常，使得皮膚抗炎因子和脂質減少，皮膚出現(xiàn)炎性反應，皮膚表面pH值升高，增加了激肽釋放酶(kallikrein，KLKs)的活性，KLKs可進一步激活PAR-2，活化的PAR-2可使板層小體掩埋在角質細胞內難以釋放，抑制其正常分泌，引起細胞間脂質水平的減少，破壞皮膚屏障功能[9-10]。激活的PAR-2還可引起炎性因子的過表達，加重皮膚組織的炎癥損傷程度，進一步破壞皮膚屏障，形成惡性循環(huán)[11]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，馬齒莧組PAR-2水平比模型組顯著降低。提示，馬齒莧可通過降低PAR-2水平，減少TWEL，恢復皮膚屏障中“泥漿”的功能，緩解急性濕疹癥狀。

皮膚屏障的完整性是預防和治療急性濕疹的前提，皮膚屏障形成的主要物質之一是FLG。若FLG基因發(fā)生無義突變，可導致絲聚合蛋白原失去活性，減少FLG的產(chǎn)生，破壞角質細胞“磚塊”結構的支架作用[12]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，急性濕疹大鼠FLG基因呈低表達，這與RIETHMULLER等[13]研究結果一致，馬齒莧組FLG基因表達比模型組明顯增加，提示馬齒莧通過增加FLG基因表達，增加FLG水平，恢復角質細胞“磚塊”結構的支架作用，從而降低TWEL，恢復皮膚屏障功能，達到治療急性濕疹的目的。

FLG基因的無義突變使FLG減少或缺失，這可引起天然保濕因子減少，導致皮膚表面偏堿性。表皮pH值的改變可激活PAR-2，降低表皮脂質的水平，增加TWEL，破壞皮膚屏障功能。本實驗發(fā)現(xiàn)，用藥后，馬齒莧組中PAR-2表達較模型組降低，F(xiàn)LG基因表達增加，提示作為急性濕疹的治療靶點，不僅PAR-2的活性改變會影響治療效果，其水平的改變也可能影響療效。

綜上所述，馬齒莧可能是通過增加FLG基因表達，降低PAR-2水平，減少TEWL，恢復皮膚屏障功能，從而發(fā)揮治療急性濕疹的作用。馬齒莧是否還可能是通過增加FLG基因的表達來抑制PAR-2的活性，達到恢復皮膚屏障功能治療急性濕疹的作用，有待進一步研究。