李堂江，向 敏，呂 欣，王 凱，張 超

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 小兒矯形外科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 心電圖科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 外科，貴州 遵義 563000)

血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤，好發(fā)于四肢軀干部位，其有自行消退趨勢。特殊部位血管瘤，如四肢關節(jié)部位、鼻尖、眼瞼、嘴唇、會陰部等在其發(fā)生、發(fā)展、消退過程中易破潰、感染，造成局部瘢痕形成，甚至出現(xiàn)毀容，因此需積極治療。目前血管瘤發(fā)病機制還不完全清楚，其治療方法也多種多樣，效果參差不齊。近年來研究發(fā)現(xiàn)基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)在所有腫瘤組織中均有高活性及高表達率。而基質金屬蛋白酶7(MMP-7)是金屬蛋白酶家族(MMPs)中最重要的酶之一，在體內參與炎癥發(fā)生、細胞增殖、血管發(fā)生發(fā)展、腫瘤轉移等生物學行為。Ki67是一種細胞增殖相關核抗原，其功能與細胞有絲分裂密切相關，在細胞增殖中不可缺少，但其確切機制尚不清楚。其數(shù)值越高，說明細胞增生越活躍，可直接、敏感地反映腫瘤細胞的增殖活性，并且較全面反映增殖細胞數(shù)量[1]。因此本研究擬通過免疫組化MaxVision法及夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELIDA)檢測MMP-7在嬰幼兒血管瘤組織中及血清中的表達情況，檢測Ki67并分析其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院2010年1月至2016年6月未經其他治療、單純行手術切除并經病理診斷為血管瘤的標本，結合Mulliken分類法和增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況重新分類，提取增生期血管瘤20例、消退期血管瘤20例。其中男23例，女17例，患兒年齡為2～36月，平均13.5月。另外取正常嬰幼兒皮膚組織20例作對照，全部標本福爾馬林浸泡，石蠟包埋后切片，行免疫組織化學檢查。ELISA方法 用EDTA抗凝管采集明確診斷，未經任何治療的增生期血管瘤36例外周血，正常36例嬰幼兒外周血標本，置4 ℃冰箱暫存，2 h內送實驗室，經低溫離心(1 500 rpm， 4 ℃，10 min)分離，取上層血漿分裝后保存-80 ℃冰箱待檢(血管瘤患者標本及正常對照組嬰幼兒的外周血清標本均收集于本院檢驗科正常體檢及住院治療血管瘤患者檢驗使用后所留血清標本，并離心后放-80 ℃冰箱待檢)。

1.1.2 主要試劑 即用型快捷免疫組化MaxVision/HRP檢測試劑盒、UItra DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；鼠抗人單克隆MMP-7抗體、鼠抗人單克隆Ki67抗體購于英國abcom公司；基質金屬蛋白酶-7(總)ELISA試劑盒購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 實驗方法 所有操作嚴格按照MaxVision/HRP檢測試劑盒說明書進行。實驗步驟簡述如下：石蠟組織塊經4 μm切片，依次脫蠟、水化，切片上滴加過氧化物酶阻斷試劑，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3分鐘；除去PBS,分別滴加一抗(鼠抗人單克隆MMP-7抗體，體積稀釋比例為1∶200濃度，鼠抗人單克隆Ki67抗體，體積稀釋比例為1∶200)，室溫孵育60 min，PBS沖洗3×3 min，除去PBS，切片上滴加MaxVision/HRP試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3×3 min；除去PBS，切片上滴加新鮮配制DAB顯色試劑顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。陽性對照以采取胃癌切片(由試劑公司提供)，以PBS代替一抗作為陰性對照。應用ELISA雙抗體夾心法檢測外周血中MMP-7蛋白水平，嚴格按照MMP-7 ELISA KIT說明書進行操作。

1.3 結果判定 免疫組化：結果以半定量積分法進行陽性結果判斷[2]。著色強度評分，0分：無著色；1分：淺黃色著色；2分：棕黃色著色；3分：棕褐色著色。 200倍鏡下每張切片10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分比：<10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。半定量免疫反應積分為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0～2分為無表達，3～4分為弱表達，6～8分為中表達，9～12為強表達。酶聯(lián)免疫吸附法：檢測結果在酶標儀上于450 nm處測定各孔的OD值。標準曲線的建立：分別以濃度為0、156、313、625、1 250、2 500、5 000 pg/mL的MMP-7標準蛋白為S0-S7標準點，檢測其OD值，以S0點為空白對照，以S0-S7標準品的濃度為縱坐標，相應的OD值為橫坐標，制作出標準品線性回歸標準曲線，求得標準曲線公式及相關系數(shù)，根據(jù)公式計算MMP-7濃度值(pg/mL)。

2 結果

2.1 正常皮膚及血管瘤組織的MMP-7表達 MMP-7在增生期血管瘤中高表達(見圖1A)，消退期血管瘤中低表達或不表達(見圖1B)，正常皮膚組織不表達(見圖1C)。MMP-7在增生期血管瘤中表達與消退期血管瘤中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)；MMP-7在增生期血管瘤中的表達水平與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

A：增生期MMP-7表達(×200)； B：消退期MMP-7表達(×200)；C：正常皮膚組織MMP-7表達(×200) 。圖1 MMP-7在正常組織、消退期及增生期血管瘤組織的染色結果

表1MMP-7在正常組織、消退期及增生期血管瘤組織中的表達(n=20)

組別無表達弱表達中等表達強表達χ2P陽性表達率正常組織2000032.7270.000?0消退期28642.1050.147??90%增生期02216400.0000???100%

比較時弱表達、 中等表達、 強表達合并為表達;*：正常組織與消退期組比較;**：消退期組與增生期組比較;***：正常組織與增生期組比較。

2.2 正常皮膚及血管瘤組織中Ki67表達 Ki67在增生期血管瘤中高表達(見圖2A)，在消退期血管瘤低表達(見圖2B)，在正常皮膚組織中不表達或弱表達(見圖2C)。Ki67在增生期血管瘤與消退期血管瘤、增生期與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

A：增生期血管瘤Ki67表達；B：消退期血管瘤Ki67表達；C：正常皮膚組織Ki67表達；(×200)。圖2 Ki67在正常組織、消退期及增生期血管瘤組織的染色結果

表2Ki67在正常組織、消退期及增生期血管瘤組織中的表達(n=20)

組別無表達弱表達中等表達強表達χ2P陽性表達率正常組織191009.5340.002?5%消退期1172010.9960.000??45%增生期2141332.7270.0000???90%

比較時弱表達、 中等表達、 強表達合并為表達;*：正常組織與消退期組比較;**：消退期組與增生期組比較;***：正常組織與增生期組比較。

2.3 血管瘤患者與正常對照血清MMP-7水平 血管瘤患兒血清中MMP-7(718.64±146.03 pg/mL)明顯高于正常對照組血清中MMP-7(238.21±48.27)，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

組別MMP-7 ( pg/mL)P增生期718.64±146.030.000168?正常238.21±48.27

與對照組比較，P<0.05。

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)MMPs家族在所有腫瘤組織中均有高活性及高表達[3-6]?；|金屬蛋白酶7(MMP-7)是金屬蛋白酶家族(MMPs)中最重要的酶之一，基因位于11q21-22，由于缺乏血紅蛋白域，MMP-7就成為MMPs家族中最小的蛋白酶[7]。MMP-7在體內參與多種組織病理和生理過程，其作用十分廣泛，可降解蛋白多糖、纖維連接素、彈力纖維及Ⅳ型膠原纖維等，是基質降解的執(zhí)行酶，在體內參與細胞增殖分化、炎癥反應、新生血管形成、腫瘤轉移等生物學行為[8-10]。MMP-7與其他MMPs之間的區(qū)別在于，它由腫瘤細胞分泌的，而其他MMPs都是腫瘤基質細胞所分泌的，這提示MMP-7的表達可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[11-12]。而嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機制目前仍然不清楚，其發(fā)生的原始動因不明確，但其發(fā)生發(fā)展過程中最本質的特征都是血管內皮細胞異常增殖，而細胞外基質的降解是血管生成的關鍵步驟，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的前提。MMP-7能降解細胞膜上的Fas配體，抑制Fas介導的細胞凋亡，促進腫瘤的生長[13]。MMP-7促進腫瘤血管的生成，已經被證明在體外實驗研究中以劑量依賴的方式，加速在人臍靜脈內皮細胞的增殖[14]。MMP-7和血管內皮細胞生長因子(VEGF)在腫瘤的血管內皮細胞中協(xié)同表達，VEGF改變了內皮細胞的活化形式，增強了MMP-7的釋放，加快了基底膜的降解和內皮細胞遷移[15]。

本研究通過對增生期、消退期血管瘤及正常皮膚組織免疫組織化學方法分析表明，在嬰幼兒血管瘤中有MMP-7及Ki67表達，在增生期高表達，在消退期低表達，在正常皮膚組織中不表達或弱陽表達。推測其促進血管瘤發(fā)生可能通過上述機制協(xié)同而促進血管內皮細胞增殖，促進新生血管形成，進而促進血管瘤的生長。有學者研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9在增生期患者血液中濃度升高[16]，MMP-9在內皮細胞遷移和血管形成中發(fā)揮重要作用[17]。目前相關文獻表明，MMP-2和MMP-9是通過β腎上腺素受體進行調控[18-21]。而MMP-2、MMP-9的活化是通過MMP-7激活其相應前體而被活化的[22]。有關文獻表明，抑制MMP-7能夠阻礙人微血管內皮細胞的血管形成[23]。

本研究通過對血管瘤患兒與正常對照組血清酶聯(lián)免疫分析結果也表明，在增生期血管瘤患兒血清中，其MMP-7的表達水平較對照組明顯升高，提示在增生期血管瘤內皮細胞中存在MMP-7大量分泌，其能加速細胞基底膜及細胞外基質的降解，在降解過程中還能誘導細胞釋放大量血管內皮生長因子，促進腫瘤新生血管和脈管形成，為腫瘤細胞的增殖提供必要的營養(yǎng)基礎與轉移途徑[24]。同時MMP-7活化MMP-2和MMP-9活性，促進血管內皮細胞遷移，促進瘤體增殖分化；而在消退期MMP-7的表達水平下降，MMP-2和MMP-9活化降低，使其合成減少，使得各種血管內皮細胞生長因子減少，不能降解細胞基底膜及細胞外基質，使血管瘤內皮細胞不能遷移，從而阻止新的血管形成[25]。而目前我們在對血管瘤患兒在口服普萘洛爾前后MMP-7水平變化的研究中也發(fā)現(xiàn)，其服藥前后血清中的MMP-7水平也有顯著差異性，推測其可能是通過β腎上腺素受體抑制劑抑制MMP-7表達，從而抑制MMP-2、MMP-9表達，使內皮細胞生成減少，促進瘤體消退，但具體機制還不明確，還需進一步研究。

本研究證實了嬰幼兒血管瘤患者在組織及血清中均有MMP-7表達，在增生期高表達，消退期低表達，正常組織中不表達或弱表達，而Ki67在增生期高表達，消退期低表達，提示MMP-7表達水平可能和血管瘤的增生、分化、消退相關，因此臨床上我們認為可以通過抑制MMP-7表達，抑制血管內皮細胞增殖，促進血管瘤的消退，但因本實驗樣本量少，其具體作用機制還需進一步研究。