朱紅蘭，劉代順，龔 玲

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563002)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ER Stress)是一種亞細胞器病理過程，在此過程中細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose regulated protein,GRP78)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為一種分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運，在應(yīng)激狀態(tài)下可以大量表達，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定、保護細胞[1]。表面活性蛋白C(Surfactant protein C,SPC)和表面活性蛋白A((Surfactant protein A,SPA)的突變，衣霉素(Tunicamycin，TM)、毒胡蘿卜素及博萊霉素的刺激，可誘導(dǎo)ER stress的發(fā)生，進而使Ⅱ型肺泡上皮細胞(AECⅡ)、腎小管上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions,EMT)；但4-苯基丁酸(4-phenylacetic acid，4-PBA)可以抑制ER stress的激活[2-6]。上述因素是通過什么途徑引起ER stress目前尚無探討。有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?Histone deacetylases，HDACs)可以影響腫瘤中ER stress的發(fā)生[7]。HDAC和組蛋白乙?；?Histone acetylt -ransferases，HATs)共同參與調(diào)控組蛋白或非組蛋白的乙?；?去乙酰化動態(tài)平衡狀態(tài)。HDAC抑制劑(Histone deacetylase inhibitor，HDACi)抑制HDAC的去乙?；钚?，是一類新型抗癌藥物；其中辛二酰苯胺異羥肟酸(Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)是一種泛抑制劑。相關(guān)研究表明HDAC1,2,3,4,6通過定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能影響腫瘤中ER stress的發(fā)生[8-11]。本研究將探討在II型肺泡上皮細胞中，HDAC是否影響ER stress發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及處理 人肺腺癌A549細胞購自美國菌種保藏中心(ATCCRCRM-CCL-185TM)，實驗中所用細胞株為第2～3代。在10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中， 37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，饑餓24 h，分別予以0.5 μg/mL衣霉素或同時分別加用不同濃度的4-PBA、SAHA處理細胞48 h。

1.2 RNA提取及半定量PCR 使用Trizol 試劑參照說明書提取總RNA，測定A260/A280吸光度判斷純度和濃度后提取2 μL總RNA使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄DNA。PCR反應(yīng)過程：反應(yīng)體系25 μL，94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，共30個PCR循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min(見表1)。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照。用Quantity one 4.62軟件分析圖像。以β-actin為內(nèi)參，以GRP78/β-actin代表其mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

表1PCR引物序列

目的基因引物 序列產(chǎn)物片段長度GRP78上游5’-TATGTCGCCTTCACTCCTGA-3'375 bp下游5’-AGTTCCAGCGTCTTTGGTTG-3'β-actin上游5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’285 bp下游5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’

1.3 Western blot 提取細胞中總蛋白的含量，用BCA蛋白定量法測定蛋白提取液中總蛋白含量。從各樣本中取50 μg總蛋白上樣于12%的SDS-PAGE凝膠進行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入一抗兔抗鼠GRP78、HDAC2、HDAC6、β-actin(美國 Cell Signaling),4 ℃孵育過夜，棄一抗后加HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG抗體，室溫搖床上孵育2h后用TBST清洗，使用ECL發(fā)光法檢測目的蛋白條帶，用Quantity one 4.62軟件分析圖像。以β-actin為內(nèi)參，以GRP78/β-actin,HDAC2/β-actin,HDAC6/β-actin代表其蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 衣霉素誘導(dǎo)ER stress 為了探討衣霉素是否可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生ER stress，應(yīng)用RT-PCR檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78 mRNA的表達。選擇0.5μg/mL衣霉素作用A549細胞不同時間(24、48、72 h)，發(fā)現(xiàn)衣霉素作用不同時間后GRP78 mRNA表達均增加(P=0.000，P=0.006，P=0.002<0.05)，(見圖1A、B)。因此，在衣霉素作用A549細胞后，GRP78 mRNA表達有增加，表明衣霉素可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生ER stress。

為了探討4-PBA能否抑制A549細胞中衣霉素所誘導(dǎo)的ER stress，應(yīng)用Western bloting檢測4-PBA與衣霉素共同作用后GRP78蛋白表達情況。衣霉素作用于A549細胞后，GRP78蛋白表達增加(P=0.000)；加入1.0mM 4-PBA后，4-PBA使衣霉素組GRP78蛋白表達下降(P=0.000見圖1C、D)。因此，4-PBA能下調(diào)A549細胞中GRP78蛋白的表達，表明4-PBA能抑制A549細胞中衣霉素所誘導(dǎo)的ER stress。

2.2 衣霉素使A549細胞HDAC活化 有研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞ER stress發(fā)生過程中有HDAC的活化參與其中，為進一步探討衣霉素所誘導(dǎo)的A549細胞ER Stress中是否也有HDAC活化參與其中，應(yīng)用Western blot檢測衣霉素作用于A549細胞后HDAC2及HDAC6蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HDAC2及HDAC6蛋白的表達增加(P=0.000，P=0.005)(見圖2A、B)，說明衣霉素可刺激A549細胞內(nèi)HDAC2及HDAC6的活化。

A、B：RT-PCR檢測A549細胞被0.5 μg/mL衣霉素(TM)分別處理0、24、48、72 h后GRP78 mRNA的表達；C、D：Western blot檢測A549細胞被0.5 μg/mL衣霉素(TM)單獨或與1.0 nM 4-PBA共同處理48 h后，GRP78蛋白的表達；**：與對照組相比，n=3，P<0.001；*：與對照組相比，n=3，P<0.01；##：與TM組相比，n=3，P<0.001；#：與TM組相比，n=3，P<0.01。圖1 TM單獨或與4-PBA共同作用于A549細胞后，GRP78 mRNA及蛋白的表達

A、B：Western blot檢測A549細胞被0.5 μg/mL衣霉素(TM)處理48 h后，HDAC2及HDAC6蛋白的表達;**:與對照組相比，n=3，P<0.001;*:與對照組相比，n=3，P<0.01。 圖2 TM作用于A549細胞后，HDAC2,6 蛋白的表達

2.3 衣霉素通過激活HDAC2，6誘導(dǎo)ER stress的發(fā)生 為了探討衣霉素誘導(dǎo)的A549細胞HDAC2、HDAC6的活化與ER stress之間是否存在關(guān)聯(lián)，應(yīng)用泛HDAC抑制劑SAHA作用于A549細胞后檢測衣霉素所誘導(dǎo)的ER Stress情況。選擇0.3μM SAHA與衣霉素共同作用，應(yīng)用Western blot檢測HDAC2及HDAC6蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與衣霉素組相比，SAHA使HDAC2及HDAC6蛋白表達減少(P=0.000，P=0.000)(見圖3A、B)。說明SAHA能抑制HDAC2及HDAC6的活化。進一步檢測SAHA與衣霉素共同作用細胞后GRP78蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)SAHA導(dǎo)致GRP78蛋白表達減少(P=0.000;見圖3C、D)。說明SAHA抑制HDAC2、HDAC6的活化后，衣霉素誘導(dǎo)的ER stress也受到了抑制，提示衣霉素可能通過激活HDAC2及HDAC6的活化誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生ER stress。

A、B：Western blot檢測A549細胞被0.5 μg/mL衣霉素(TM)單獨或與0.3 μM SAHA共同處理48 h后，HDAC2及HDAC6蛋白的表達;C、D:Western blot檢測A549細胞被0.5 μg/mL衣霉素(TM)單獨或與0.3 μM SAHA共同處理48 h后，GRP78蛋白的表達;**：與對照組相比，n=3，P<0.001;*:與對照組相比，n=3，P<0.01;##:與TM組相比，n=3，P<0.001;#:與TM組相比，n=3，P<0.01。 圖3 TM單獨或與SAHA共同作用于A549細胞后HDAC2、HDAC6及GRP78蛋白的表達

3 討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細胞轉(zhuǎn)化為能動的間質(zhì)細胞的過程，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、器官纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。它的發(fā)生與多種轉(zhuǎn)錄因子、蛋白分子及生長因子等相關(guān)，其中涉及到復(fù)雜的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12]。

已經(jīng)有報道發(fā)現(xiàn)，衣霉素、毒胡蘿卜素以及SPC和SPA的突變誘導(dǎo)的ER stress可以介導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生EMT[3-4]。有相關(guān)的研究表明，某些遺傳、環(huán)境因素如吸煙、慢性誤吸、病毒感染、黏蛋白5B基因啟動子區(qū)域的多態(tài)性，端粒酶基因突變，SPC和SPA的突變等可能會刺激肺泡上皮細胞發(fā)生ER stress，進而導(dǎo)致EMT的發(fā)生[13-15]。但是這些因素是如何誘導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生ER stress的，其機制并不清楚。近年來，HDAC在調(diào)控多種生理和病理過程中至關(guān)重要，且HDAC的抑制劑對幾種癌癥及纖維化疾病有著強有力的抑制作用。在某些腫瘤細胞中，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的HDAC1,2,3,4,6影響ER stress的發(fā)生，而應(yīng)用HDAC的抑制劑后能發(fā)揮抗腫瘤的作用[8-11]。本研究表明衣霉素通過激活HDAC2,6誘導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生ER stress。那么是否還有其他的HDAC參與其中，這需要我們進一步探討。

綜上所述，在肺泡上皮細胞中，HDAC2,6可誘導(dǎo)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。這可能為EMT發(fā)生機制的研究提供可能的方向，為進一步探討相關(guān)疾病提供可能的依據(jù)。