王 鴻，徐 鵬，陳 玲，曹志敏，袁 陽

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸二科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)感染引起的慢性傳染病。隨著耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)，全球結(jié)核病疫情日益嚴(yán)峻。據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織(World health organization，WHO)估算，2017年全球約有1 000萬新發(fā)結(jié)核病病例，耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)病例約46萬[1]。

吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)是重要的抗結(jié)核治療藥物，臨床上用于治療敏感及耐多藥結(jié)核病，與其它抗結(jié)核藥物聯(lián)用可顯著縮短抗結(jié)核病化療療程。PZA需在酸性條件下，由結(jié)核分枝桿菌pncA基因編碼的吡嗪酰胺酶(PZase)，轉(zhuǎn)化為吡嗪酸(Pyrazinoic acid，POA)，才能發(fā)揮殺菌活性。pncA突變導(dǎo)致的PZase活性降低或喪失，是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生PZA耐藥的主要機(jī)制[2]。通過pncA基因測序，檢測PZA耐藥性的方法，其特異性及敏感性均超過90%[3-6]。雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)為基礎(chǔ)的表型藥物敏感試驗(yàn)(Drug sensitivity test，DST)是檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但PZA表型藥物敏感試驗(yàn)需要的酸性培養(yǎng)條件，本身會抑制細(xì)菌生長，另外影響pH變化的諸多因素(如接種量等)，均可導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果[7-8]。因此，許多研究特別是PZA耐藥率的調(diào)查都采用檢測pncA突變的分子藥物敏感試驗(yàn)[9-10]。

了解藥物的耐藥情況，對于臨床制定科學(xué)合理的結(jié)核病治療方案、增加治愈率、減少復(fù)發(fā)率尤為重要。近年來，異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，由于常被誤診為敏感導(dǎo)致治療失敗，逐漸被學(xué)界重視，該現(xiàn)象是敏感株與耐藥株共存產(chǎn)生的部分菌株敏感部分菌株耐藥的現(xiàn)象[11-12]，因此，通過檢測是否同時存在敏感和耐藥基因型即可進(jìn)行判斷。由于多重感染造成的異質(zhì)性耐藥往往是當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病嚴(yán)重傳播的表現(xiàn)，而由于耐藥突變產(chǎn)生的異質(zhì)性耐藥則是治療過程中產(chǎn)生的獲得性耐藥，顯示細(xì)菌群體正由敏感菌株向耐藥菌株轉(zhuǎn)變的過程。本研究針對治療結(jié)核病的重要藥物PZA，通過pncA基因測序，研究臨床菌株P(guān)ZA耐藥率、分析異質(zhì)性耐藥水平及其產(chǎn)生原因，為治療方案的制定和調(diào)整提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究對2011～2016年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集的184株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行研究。

1.2 比例法藥物敏感性試驗(yàn) 為了解結(jié)核分枝桿菌耐藥性，根據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[13]，使用比例法對異煙肼(isoniazide，INH)、利福平(rifampicin，RFP)進(jìn)行耐藥性鑒定。若RFP和INH都敏感則判定為全敏感，RFP耐藥INH敏感則判定為單耐RFP，RFP敏感INH耐藥則判定為單耐INH，RFP和INH都耐藥則判定為MDR。

1.3pncA基因測序及異質(zhì)性耐藥分析 應(yīng)用CTAB法對培養(yǎng)菌株提取DNA[14]。使用pncA-F、pncA-R引物擴(kuò)增pncA基因(pncA-F：5’-GCTGGTCATGTTCGCGATCG-3，pncA-R：5’-GCTTGCGGCGAGCGCTCCA-3’) ，產(chǎn)物大小為681bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，70℃ 30s，32個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測序。測序結(jié)果以H37Rv序列作為參比序列，使用Lasergene軟件進(jìn)行對比分析，鑒定突變位點(diǎn)。所有pncA基因突變(除了同義突變)菌株都判斷為PZA耐藥，如果存在野生和突變序列共存，則判定為PZA異質(zhì)性耐藥。

1.4 結(jié)核分枝桿菌9位點(diǎn)VNTR基因型分型 為尋找異質(zhì)性耐藥原因，鑒定異質(zhì)性耐藥菌株是否存在混合感染和潛在的交叉污染，采用TB Typing Kit VNTR-9(9位點(diǎn)分別為QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、MIRU40、Mtub21、Mtub04、VNTR233)試劑盒(康為世紀(jì)公司)，按試劑盒使用說明書進(jìn)行VNTR基因分型。

2 結(jié)果

2.1 吡嗪酰胺耐藥與異質(zhì)性耐藥的比例 通過對184株臨床結(jié)核分枝桿菌(全敏感106株，單耐RFP 1株，單耐INH 3株，MDR 74株)pncA基因測序，共發(fā)現(xiàn)49株P(guān)ZA耐藥(見表1)，PZA耐藥占比為26.6%(49/184)，其中6株為全敏感菌株，41株為MDR菌株，分別占全敏感和MDR菌株的5.7%(6/106)和55.4%(41/74)，MDR菌株的PZA耐藥占比顯著高于全敏感菌株(P<0.01)，MDR菌株同時PZA耐藥的風(fēng)險較敏感菌株高出近21倍(Odds ratio，OR=20.71)，95% 置信區(qū)間(Confidence interval，CI)為7.67～63.81。通過分析測序圖譜，共發(fā)現(xiàn)10株存在突變和野生序列共存的現(xiàn)象(見圖1)，判定為異質(zhì)性耐藥。在49株P(guān)ZA耐藥菌株中，總體異質(zhì)性耐藥占比為20.4%(10/49)，其中全敏感和MDR菌株的PZA異質(zhì)性耐藥比分別為66.7%(4/6)和14.6%(6/41)(見表1)，全敏感菌株的異質(zhì)性耐藥比顯著高于MDR菌株(P<0.01)，全敏感菌株是PZA異質(zhì)性耐藥的危險因素(OR=11.67)，95%CI為1.24～114.21。

表1吡嗪酰胺耐藥與異質(zhì)性耐藥構(gòu)成比

耐藥程度總例數(shù)PZA耐藥(n)PZA耐藥比(%)異質(zhì)性耐藥(n)異質(zhì)性耐藥比(%)?全敏感10665.7466.7單耐RFP11100.000.0單耐INH3133.300.0MDR744155.4614.6合計(jì)1844926.61020.4

*：異質(zhì)性耐藥比例(%)為在PZA耐藥菌株中，異質(zhì)性耐藥的比例，即PZA異質(zhì)性耐藥數(shù)/總耐藥數(shù)×100%。

圖1 異質(zhì)性耐藥菌株pncA基因測序結(jié)果

2.2 吡嗪酰胺異質(zhì)性耐藥的pncA突變類型 在10株異質(zhì)性耐藥菌株中，有2株樣本同時存在2個pncA基因突變，其余8個樣本均只含有1個突變，其中2株突變位點(diǎn)相同，因此，共有11種pncA基因突變類型，其中一個為終止突變，其余都為氨基酸改變的非同義突變(見表2)。為了進(jìn)一步評估這些突變與PZA耐藥的關(guān)系，通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)突變(63.6%，7/11)都已有報道與PZA耐藥相關(guān)。

表210例吡嗪酰胺異質(zhì)性耐藥菌株pncA基因突變結(jié)果

菌株編號表型DSTa核苷酸突變類型氨基酸突變類型與本結(jié)果相關(guān)的文獻(xiàn)b201510664y全敏感A226A/CT76T/P[15,16]T416T/CV139V/A[15]20162397y全敏感T62T/CcV21V/A[17]20154449y全敏感A170A/GH57H/R[18]20162937y全敏感C205C/GcP69P/A[19,20,21]20140617MDRC425C/TT142T/M[22,23]2011057MDRG109G/AcE37E/Kc本研究T134T/GV45V/G[24]201510579yMDRA212A/GH71H/R[25]20155229yMDRC364C/TcQ122Q/stopc本研究20162407yMDRG304G/AA102A/T[26]20155078MDRT62T/CcV21V/A[17]

a:DST(drug sensitivity test,藥物敏感試驗(yàn))；b:本研究結(jié)果相一致的參考文獻(xiàn)；c:本研究新發(fā)現(xiàn)的核苷酸和/或氨基酸突變。

2.3 結(jié)核分枝桿菌9位點(diǎn)VNTR分型 為分析PZA異質(zhì)性耐藥菌株是否存在多重感染或?qū)嶒?yàn)室交叉污染，本研究對異質(zhì)性耐藥菌型進(jìn)一步進(jìn)行9位點(diǎn)VNTR分型。結(jié)果顯示，所有菌株均為單一基因型，因此排除了多重感染和實(shí)驗(yàn)室交叉污染的可能。

3 討論

PZA可以殺死休眠或半休眠的結(jié)核分枝桿菌，是縮短結(jié)核病療程、提高治愈率、降低復(fù)發(fā)率的重要藥物。為研究臨床PZA耐藥水平及異質(zhì)性耐藥情況，本研究對臨床收集的184株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行pncA基因測序。結(jié)果顯示，49株存在pncA突變，突變占比為26.6%(49/184)，其中多數(shù)突變株為MDR菌株(41/49，83.7%)；通過分析測序圖譜，共發(fā)現(xiàn)10株存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，占突變總數(shù)的20.4%(10/49)。進(jìn)一步9位點(diǎn)VNTR檢測，結(jié)果顯示所有異質(zhì)性耐藥菌株都為單一VNTR基因型，排除了實(shí)驗(yàn)室交叉污染，且不存在多重感染的可能，因此，這些PZA異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象顯示了治療過程中，病人體內(nèi)的細(xì)菌群體，由敏感菌株向耐藥菌株過渡的過程。

由于PZA的表型藥敏必須在酸性條件(pH值5.5～6.0)下進(jìn)行，導(dǎo)致該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較低，以檢測pncA耐藥突變?yōu)榛A(chǔ)的分子藥敏試驗(yàn)，由于敏感性和特異性都超過90%，是大范圍篩查PZA耐藥的有力工具[7]。由于PZA的耐藥突變，散布于整個561 bp的pncA基因，因此本研究使用pncA基因測序的方法研究PZA耐藥水平及異質(zhì)性耐藥情況。測序共發(fā)現(xiàn)11種pncA突變類型，其中7種已在PZA耐藥菌株中多次報道，剩余4種新突變中，有2種在相同密碼子的突變也已報道與該藥物耐藥相關(guān)，另有一種可能對酶活性產(chǎn)生重要影響的終止突變(Q122Q/stop)(見表2)，顯示本研究檢測的絕大多數(shù)pncA突變都與PZA耐藥性相關(guān)。

根據(jù)耐藥菌產(chǎn)生原因，結(jié)核分枝桿菌耐藥可分為兩類：一類為原發(fā)性耐藥，是指由于感染耐藥結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的耐藥；另一類為獲得性耐藥，是指在結(jié)核病治療過程中由于藥物壓力篩選出耐藥菌株導(dǎo)致的耐藥。因此，敏感菌株和耐藥菌株共存的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，其產(chǎn)生原因主要有兩種，一種是由于多重感染，即患者同時感染敏感菌株和耐藥菌株；另一種是在藥物壓力下新篩選出的獲得性耐藥菌株，耐藥細(xì)菌群體不斷擴(kuò)增，正在由敏感菌株向耐藥菌株轉(zhuǎn)變的中間狀態(tài)[27]。目前檢測異質(zhì)性耐藥的方法主要有DNA直接測序法、分子線性探針法、全基因組測序等。直接測序可以鑒定特定位點(diǎn)突變，但只能測定單個基因型，且敏感性低[27-28]；分子線性探針法對常見耐藥基因的檢測具有較高敏感性、特異性，但其受探針數(shù)目的限制，檢測覆蓋的區(qū)域較短，可能出現(xiàn)假陰性[29]；全基因組測序可檢測所有基因突變位點(diǎn)，敏感性高，但是其成本高，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，不適用于臨床檢測[27,29]。研究異質(zhì)性耐藥產(chǎn)生原因，對于控制異質(zhì)性耐藥尤為重要，對于混合感染引起的異質(zhì)性耐藥，應(yīng)加強(qiáng)疾病預(yù)防和控制，切斷傳染源，減少傳播，提高人體免疫力；對于治療過程產(chǎn)生的異質(zhì)性耐藥，則應(yīng)在貫徹DOTs策略的同時，設(shè)計(jì)合理有效的治療方案，減少獲得性耐藥的產(chǎn)生[30]。本次對184株臨床樣本研究發(fā)現(xiàn)，PZA耐藥占比為26.6%(49/184)，其中異質(zhì)性耐藥占比為20.4%(10/49)。為探明異質(zhì)性耐藥產(chǎn)生原因，對所有樣本進(jìn)行了9位點(diǎn)VNTR基因分型，顯示所有樣本都為單一VNTR基因型，因此排除多重感染或?qū)嶒?yàn)室污染的可能。由此可見，本研究檢測的所有PZA異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象均為在治療過程中產(chǎn)生的獲得性耐藥，提示應(yīng)該優(yōu)化治療方案，提高患者的依從性。

認(rèn)識本地區(qū)不同耐藥類型菌株中PZA異質(zhì)性耐藥風(fēng)險，對于指導(dǎo)臨床用藥有著重要意義。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在49株P(guān)ZA耐藥樣本中，全敏感菌株(RFP和INH敏感)的異質(zhì)性耐藥占比為66.7%(4/6)，而MDR樣本中為14.6%(6/41)，顯示與MDR菌株相比，敏感菌株更易產(chǎn)生PZA異質(zhì)性耐藥(P<0.01)。與其它研究結(jié)果類似，本研究顯示，在MDR菌株中PZA的耐藥占比較高，達(dá)55.4%，因此對于MDR患者的治療方案，應(yīng)謹(jǐn)慎使用PZA；而對于全敏感菌株，PZA的耐藥占比較低，僅為5.7%，但其中異質(zhì)性耐藥占比卻較高，達(dá)66.7%，表明在初始治療階段絕大多數(shù)的敏感結(jié)核病患者可以使用含有PZA的治療方案，但在治療過程中發(fā)生PZA異質(zhì)性耐藥的風(fēng)險較高，應(yīng)當(dāng)定期監(jiān)控該藥物的耐藥情況，及時根據(jù)耐藥性的變化調(diào)整治療方案。