張 歆，馮 飛，李園園，巴智勝，黃南渠，羅 勇

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563002；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，貴州 遵義 563002)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征在于老年人的進(jìn)行性認(rèn)知功能和行為障礙。根據(jù)國(guó)際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2016年度報(bào)告顯示，中國(guó)約有950萬(wàn)癡呆患者，到2030年可能超過(guò)1 600萬(wàn)[1]。由于缺乏有效的治療藥物，AD將成為未來(lái)中國(guó)面臨的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然到目前為止尚未充分了解AD的確切病因，但遺傳證據(jù)已證明淀粉樣蛋白-β(Amyloid-β，Aβ)是通過(guò)β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)順序切割淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)而產(chǎn)生的，BACE1在AD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[2]。作用于BACE1的抑制劑，可能是有AD潛在風(fēng)險(xiǎn)的人的有效預(yù)防策略。

淫羊藿素(Icaritin，ICT)，一種來(lái)自傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥淫羊藿的異戊二烯類(lèi)衍生物，分子量為386.4，具有良好的脂溶性，易于通過(guò)血腦屏障。研究表明ICT能增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞活力[3]，減弱由Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元毒性[4-5]。而天然黃酮類(lèi)化合物可作為非肽類(lèi)BACE1抑制劑，有效抑制BACE1活性并降低Aβ的分泌水平。本課題組長(zhǎng)期從事ICT治療AD的研究，采用多種AD模型證實(shí)ICT對(duì)AD的治療作用，發(fā)現(xiàn)ICT可改善Aβ25-35海馬注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶減退，與其激活A(yù)MP依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，抑制BACE1有關(guān)[6-7]。但I(xiàn)CT與來(lái)自的Merck的verubecestat(或MK-8931)和AstraZeneca的AZD3293(或LY3314814)的BACE1的抑制劑不同[8-10]。ICT作為一種生物活性小分子，對(duì)APP代謝具有更廣泛的藥理學(xué)修飾。為了進(jìn)一步探索ICT對(duì)Aβ生成的調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要探討ICT對(duì)BACE1的調(diào)控及其神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng) APP-PS1-HEK293細(xì)胞系購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。APP-PS1-HEK293細(xì)胞以DMEM/High培養(yǎng)基(Hyclone，SH30022.01B)[含10%胎牛血清(BI，04-001-1A)，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL(Hyclone，SV30010)]于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 ICT(純度>98.3%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；MTT購(gòu)自合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；LDH測(cè)定試劑盒、DAPI(C1002)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL試劑盒購(gòu)自賽默飛中國(guó)；ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自R&D中國(guó)；BACE1熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Panvera；BACE1(ab2077)抗體，PS1抗體(ab76083)，ADAM10抗體(ab1997)，Aβ1-40抗體(ab20068)，GAPDH抗體(ab8245)和山羊抗兔IgG H&L(DyLight 488)購(gòu)自Abcam中國(guó)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗體購(gòu)自上海Abmart。

1.3 主要儀器 電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；BCD-539WT對(duì)開(kāi)門(mén)冰箱：中國(guó)Haier公司；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)板：蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；XW-80A型漩渦混合器：江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠(chǎng)；蛋白變性?xún)x、Centrifuge 5417 R冷凍離心機(jī)、Research plus手動(dòng)移液器：德國(guó)Eppendorf 公司；Multiskan Go 酶標(biāo)儀、Forma 3131二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；熒光倒置顯微鏡1X73、光學(xué)顯微鏡BX43：日本Olympus公司；-80℃超低溫冰箱立式MDF-382E(CN)、SIM-F124制冰機(jī)：日本SANYO公司。

1.4 主要方法

1.4.1 IC50測(cè)定 根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用BACE1 FRET試劑盒進(jìn)行BACE1酶抑制試驗(yàn)。在DMSO中制備化合物的儲(chǔ)備溶液。將樣品在測(cè)定緩沖液中進(jìn)一步稀釋以制備3×濃度的測(cè)試化合物。在黑色的96孔微量培養(yǎng)板的不同孔中，將10 μL BACE1底物(3×濃度)加入10 μL 3×濃度的每種測(cè)試化合物中并輕輕混合。然后向每個(gè)孔中加入10 μL 3× BACE1酶以開(kāi)始反應(yīng)。將平板在黑暗中于25 ℃溫育90 min。然后，向每個(gè)孔中加入10 μL終止緩沖液(乙酸鈉)以終止反應(yīng)。最后，分別在545 nm和585 nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光測(cè)量。通過(guò)將獲得的每小時(shí)相對(duì)熒光單位(RFU/h)與抑制劑濃度的對(duì)數(shù)作圖來(lái)計(jì)算IC50值。通過(guò)非線(xiàn)性回歸(曲線(xiàn)擬合)在GraphPad Prism 7中分析測(cè)量的抑制數(shù)據(jù)。

1.4.2 MTT及LDH檢測(cè)細(xì)胞活力及毒性 將用96孔板(5000個(gè)/孔)培養(yǎng)的APP-PS1-HEK293細(xì)胞用0.1～100 μmol/L的ICT處理16 h。除去培養(yǎng)基，向各孔中加入50 μL含MTT(0.5 mg/mL)的DMEM。將細(xì)胞在37 ℃下孵育3 h，加入150 μL DMSO進(jìn)行溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)量570 nm處的吸光度。根據(jù)制造商的方案，在細(xì)胞處理后，使用LDH測(cè)定試劑盒檢測(cè)LDH漏出率，在490 nm處測(cè)量吸光度。

1.4.3 ELISA測(cè)定Aβ1-40用0.5～10 μmol/L的ICT處理APP-PS1-HEK293細(xì)胞16 h后，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞。吸取每瓶細(xì)胞的培養(yǎng)基，2 000 r/min離心10 min后取上清用于檢測(cè)細(xì)胞外Aβ1-40；同時(shí)每瓶剩下的細(xì)胞需加入RIPA裂解液200 μL及PMSF 2 μL冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刮下，于4℃離心機(jī)里以10 000 r/min離心15 min，收集的上清液用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40。ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.4 免疫熒光測(cè)定BACE1 用0.5～10 μmol/L的ICT處理16h后，將蓋在蓋玻片上的細(xì)胞在-20 ℃下用甲醇固定20 min，在室溫下用0.1%Triton X-100的PBS處理5 min，用含5%牛血清白蛋白的PBS封閉30 min，然后與BACE1抗體(1∶1 000)在37 ℃溫育2 h。經(jīng)PBS洗滌后，在37 ℃下與綴合有Dylight 488(1∶1 000)的二抗在黑暗中孵育1 h。然后在室溫下，在暗處將細(xì)胞用DAPI進(jìn)一步染色2 min并洗滌。然后，使用Olympus BX43F熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.4.5 Western blot測(cè)定BACE1、PS1、ADAM10和Aβ1-40的表達(dá) 如前所述,培養(yǎng)后制備APP-PS1-HEK293細(xì)胞裂解物。在4℃裂解緩沖液處理30 min后，通過(guò)在12 000 rpm離心30min除去不溶物質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Generay，GK5012)測(cè)定裂解物的蛋白質(zhì)濃度。然后通過(guò)SDS-PAGE(Beyotime，P0012AC)分離等量(10 μg)的每種樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Merck，IPVH00010)。將膜在5%脫脂牛奶的TBST溶液中封閉1 h，TBST洗滌后，在4 ℃下與抗體孵育過(guò)夜：BACE1(1∶1 000)，PS1(1∶1 000)，ADAM10(1∶1 000)，Aβ1-40(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

用TBST在10min內(nèi)洗滌膜3次，并與HRP綴合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗體(1∶5 000)一起在室溫孵育1h。然后，用TBST洗滌膜3次，并使用ECL試劑盒顯現(xiàn)。用Quantity Ones軟件(Bio-Rad)定量條帶的強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用ONE-WAY ANOVA分析處理，方差齊用LSD法；方差不齊用Dunnett′T3法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IC50ICT以濃度依賴(lài)性方式抑制BACE1的活性，IC50為5.70±1.09 μmol/L(見(jiàn)圖1)。

ICT對(duì)BACE1的IC50，IC50為5.70±1.09 μmol/L(Mean±SEM,n=3)。圖1 用FRET法測(cè)定ICT對(duì)BACE1活性的影響

2.2 ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞的保護(hù)作用 與對(duì)照組相比，當(dāng)ICT濃度為(5～10 μmol/L)時(shí)，APP-PS1-HEK293細(xì)胞的活力增加(P<0.05)，細(xì)胞的LDH漏出率下降(P<0.05)。這些結(jié)果表明ICT在濃度為(5～10 μmol/L)時(shí)對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞具有保護(hù)作用(見(jiàn)圖2)。

A：ICT對(duì)細(xì)胞活力的影響;B：ICT對(duì)LDH泄漏率的影響(*:與對(duì)照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3)。圖2 ICT在APP-PS1-HEK293細(xì)胞中的保護(hù)作用

2.3 ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Aβ1-40的影響 經(jīng)過(guò)處理后，在APP-PS1-HEK293細(xì)胞和培養(yǎng)基中，通過(guò)ELISA測(cè)量Aβ1-40的含量。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40含量高于細(xì)胞外(P<0.05)，并且通過(guò)ICT處理，與對(duì)照組相比，Aβ1-40含量降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

A：Aβ1-40的細(xì)胞外濃度;B：細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40濃度；*:與對(duì)照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3。圖3 ICT(0.5、5、10 μmol/L)對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞中細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40的影響

2.4 ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞中BACE1表達(dá)的影響 如圖4所示，藍(lán)色熒光為DAPI代表細(xì)胞核，綠色熒光為BACE1。隨著ICT濃度的增加，BACE1熒光強(qiáng)度減少，表明ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞中的BACE1表達(dá)具有抑制作用。

藍(lán)色熒光代表APP-PS1-HEK293細(xì)胞的細(xì)胞核，綠色熒光代表BACE1(比例尺為20 μm)。圖4 ICT降低APP-PS1-HEK293細(xì)胞中BACE1的表達(dá)

2.5 ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞中Aβ形成途徑的影響 為了研究Aβ是否真的減少了并且Aβ生成途徑是否參與APP-PS1-HEK293細(xì)胞中ICT的保護(hù)作用，我們檢測(cè)了Aβ1-40和該途徑中涉及的一些蛋白。如圖5所示，相對(duì)于對(duì)照，ICT處理的APP-PS1-HEK293細(xì)胞中Aβ1-40表達(dá)明顯減少(P<0.05)，ADAM10表達(dá)增加(P<0.05)，BACE1表達(dá)降低(P<0.05)，PS1表達(dá)降低(P<0.05)。

A：代表性條帶;B：ADAM10的蛋白質(zhì)水平;C：BACE1的蛋白質(zhì)水平;D：PS1的蛋白質(zhì)水平;E：Aβ1-40的蛋白質(zhì)水平(*:與對(duì)照相比P<0.05,Mean±SEM,n = 3)。圖5 ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞Aβ形成途徑相關(guān)蛋白的影響

3 討論

中醫(yī)藥是我國(guó)數(shù)千年醫(yī)藥實(shí)踐的結(jié)晶，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中尋找難治疾病的治療策略極具潛力。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為腎與腦關(guān)系密切，自古便有“腎主骨生髓，腦為髓之?！钡睦碚?。中醫(yī)理論認(rèn)為腦的功能強(qiáng)健與否主要取決于腎中精氣之盈虧[11]。AD為癡呆之癥的主要類(lèi)型，因此，根據(jù)中醫(yī)理論，補(bǔ)腎陽(yáng)的中藥將會(huì)是治療AD的新希望。

淫羊藿(EpimediumL.)是貴州省道地中藥材，為小蘗堿科多年生直立草本植物淫羊藿的地上部分，是傳統(tǒng)補(bǔ)益類(lèi)中藥之一[12]。因此，基于中醫(yī)理論可以推斷淫羊藿或其有效成分在治療AD方面具有重要價(jià)值[13]。ICT是淫羊藿中提取出的黃酮類(lèi)有效成分之一，本課題組前期發(fā)現(xiàn)ICT可改善Aβ25-35海馬注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶減退，與其激活A(yù)MPK，抑制BACE1有關(guān)[6-7]。在本實(shí)驗(yàn)條件下，類(lèi)似于其它黃酮類(lèi)化合物如槲皮素和芹菜素[14]，ICT以濃度依賴(lài)性方式抑制BACE1的活性，IC50為5.70±1.09 μmol/L。當(dāng)ICT(5～10 μmol/L)時(shí)，APP-PS1-HEK293細(xì)胞的活力增加，LDH漏出率下降，表明ICT在該濃度范圍具有保護(hù)作用。而與對(duì)照組相比，ICT對(duì)APP-PS1-HEK293細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的Aβ1-40均有降低作用。那ICT是如何調(diào)控Aβ的呢？

研究表明APP是Aβ的來(lái)源，它可被α-分泌酶(ADAM10)、β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(PS1)分解，其中被BACE1和PS1加工產(chǎn)生Aβ，而被ADAM10加工卻被清除[15]。小檗堿可通過(guò)抑制BACE1改善3×Tg-AD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶功能[16]。很多化合物(維甲酸、沒(méi)食子酸、隱丹參酮、藁本內(nèi)酯、白果內(nèi)酯等)可通過(guò)ADAM10刺激非淀粉樣蛋白生成途徑，促進(jìn)APP水解，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。在本研究中，ICT(5～10 μmol/L)可降低APP-PS1-HEK293細(xì)胞的BACE1和PS1蛋白表達(dá)，減少Aβ1-40的生成。與此同時(shí)，ICT增加了ADAM10的表達(dá)，可能發(fā)揮了清除APP的作用。并且，在這3個(gè)酶中，BACE1的變化最為明顯。因此，ICT具有抗Aβ生成的作用，其機(jī)制可能主要與其抑制BACE1有關(guān)。這不僅為ICT用于治療AD奠定基礎(chǔ)，也為淫羊藿的開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)。