蹇明輝，陳文明，李朝富

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目前，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)是治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)最為有效的手段之一，但是，PCI術(shù)后血管再度狹窄(Restenosis,RS)的發(fā)生率仍然高達17%～32%[1-2]。在PCI術(shù)后血管再狹窄發(fā)生、發(fā)展的過程中，血管平滑肌細胞(Vasclar smooth muscle cell,VSMC)的過度增殖和遷移起著非常重要的作用[3]，如果能有效抑制VSMC過度的增殖和遷移，那么，PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生就有能得到有效的控制。單核細胞趨化蛋白-1誘導(dǎo)蛋白(Monocyte chemotactic protein-1 induced protein，MCPIP) 是一個具有轉(zhuǎn)錄活性，或有RNase活性的鋅指蛋白，參與細胞內(nèi)的多種病理過程，研究表明MCPIP是與心血管疾病、炎癥、自身免疫等相關(guān)的一種多功能蛋白[4-6]。研究還證實，在動脈粥樣硬化模型鼠主動脈中，發(fā)現(xiàn)MCPIP mRNA 表達量比野生型鼠增加了2.5倍；在人的動脈粥樣硬化斑塊組織中發(fā)現(xiàn) MCPIP 表達較正常血管組織明顯增加[7]。在PCI術(shù)后再狹窄進程中，MCPIP 是否參與其中，作者未見文獻報道。因此，本研究通過建立球囊損傷動脈模型，模擬PCI術(shù)后再狹窄的過程，探討血管損傷后MCPIP 的表達變化與血管新生內(nèi)膜形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 MCPIP和β-actin一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-Time PCR反應(yīng)試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；2.0 mm×12.0 mm球囊導(dǎo)管(美國Baxter Healthcare公司)；BX43顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；MCPIP和β-actin引物(廣州銳博生物科技有限公司)。

表1引物序列和擴增產(chǎn)物長度

引物名稱引物序列基因擴增片段長度MCPIP上游 TCGGCCAGATGTG CCTATCA191 bp下游 CTTGGAGGTCCCGGTATG TG TCβ-actin上游 CCACGAACTACCTTCAACTCC132bp下游 GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT

1.2 實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠50只(由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供)，體重 300±20 g，隨機為成 5 組：假手術(shù)組，損傷后3、7、14、28 d組，每組10只。

1.3 大鼠頸動脈球囊損傷模型建立 參照文獻建立頸動脈球囊損傷模型[8-9]，大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(10%，3 mL/kg)麻醉后再注射肝素鈉(625 U/kg)。固定大鼠，于頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸外和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠端，用0號絲線臨時阻斷左頸總動脈血流。球囊導(dǎo)管(2.0 mm×12.0 mm)由頸外動脈進入頸總動脈，將球囊充盈。把充盈的球囊在頸總動脈內(nèi)緩慢來回反復(fù)抽拉3次，退出球囊，結(jié)扎頸外動脈。假手術(shù)組大鼠只分離左頸總動脈血管。術(shù)后給予青霉素(30萬單位)肌肉注射，連續(xù)3d，每天1次。分別于3、7、14、28 d處死大鼠，留取頸動脈血管組織。

1.4 頸動脈血管組織HE染色 損傷的頸動脈血管經(jīng)石蠟包埋、切片行HE染色，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，用(Image-pro Plus)IPP圖像分析軟件測量血管腔面積 (LA)、內(nèi)彈力板圍繞面積(IELA)、外彈力板圍繞面積(EELA)，計算內(nèi)膜面積 (IA)和中膜面積(MA)，其中 IA=IELA-LA，MA=EELA-IELA，每個樣本切片 5張，分別測量后取平均值，并計算 IA/MA。

1.5 Western blot法檢測MCPIP的蛋白表達 將損傷的頸動脈血管組織用蛋白提取液提取蛋白，然后進行蛋白定量，并確定蛋白的上樣濃度(60 μg)。制膠上樣，恒壓電泳和轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，將膜用脫脂奶粉封閉 2 h，加入一抗(MCPIP 1∶200、β-actin 1∶200)，于冰箱4℃過夜，加二抗孵育1 h，于BIO-RAD凝膠成像儀顯影，對電泳條進行分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 Real-time PCR法檢測MCPIP的mRNA表達 頸動脈損傷血管組織按照RNA提取操作步驟提取RNA，將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，首先確認引物的反應(yīng)性，確定反應(yīng)體系(25 μL)，按照PCR反應(yīng)擴增步驟進行：① 預(yù)變性：95 ℃、5 min；②PCR反應(yīng)42個循環(huán)：95 ℃，15 s ，60 ℃，40 s；③融解曲線：95 ℃，5 s，60 ℃，5 min。目的基因的相對表達量=目的基因表達/內(nèi)參β-actin基因表達。

2 結(jié)果

2.1 大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組血管內(nèi)膜光滑，無明顯增厚現(xiàn)象，頸動脈球囊損傷后 3 d，血管內(nèi)膜無明顯增生，7 d 時，可見新生內(nèi)膜，增生的平滑肌細胞向內(nèi)膜下遷移，管腔開始狹窄，各損傷組內(nèi)膜/中膜面積比值明顯增大(P<0.01)；14 d 時，可見明顯新生內(nèi)膜，平滑肌細胞排列紊亂，管腔明顯狹窄，內(nèi)膜面積超過中膜(P<0.01)；28 d 時，血管內(nèi)膜繼續(xù)不規(guī)則增生，血管腔狹窄程度繼續(xù)加重，管腔面積狹窄程度更加明顯(P<0.01，見圖1、表1)。

A:假手術(shù)組;B:損傷7 d組;C:損傷14 d組;D:損傷28 d組;I：內(nèi)膜；M：中膜。 圖1 HE染色觀察大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的變化(×400)

組別內(nèi)膜面積(IA)(mm2)中膜面積(MA)(mm2)內(nèi)膜/中膜面積比值(IA/MA)假手術(shù) 0.009±0.0010.115±0.0110.078±0.008損傷3 d 0.013±0.0020.097±0.0070.134±0.007損傷7 d 0.112±0.036??0.106±0.0171.056±0.447??損傷14 d 0.205±0.021??0.099±0.0132.070±0.325??損傷28 d 0.315±0.028??0.109±0.0342.890±0.142??

**：與假手術(shù)組比較，P<0.05。

2.2 大鼠頸動脈球囊損傷后血管MCPIP mRNA表達變化 Real-Time PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，大鼠頸動脈球囊損傷3 d 后，損傷血管壁MCPIP mRNA表達開始增加，但是無統(tǒng)計學(xué)意義，隨損傷時間的延長，MCPIP mRNA表達量也呈上升趨勢，至損傷后28 d，MCPIP mRNA 達到最高值(P<0.01，見圖2)。

**：與假手術(shù)組比較，P<0.05；1：假手術(shù)組；2：損傷3 d；3：損傷7 d；4：損傷14 d；5：損傷28 d。圖2 損傷血管 MCPIP mRNA的表達變化

2.3 大鼠頸動脈球囊損傷血管MCPIP蛋白的表達變化 Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，大鼠頸動脈球囊損傷3d后，血管壁損傷MCPIP 蛋白表達無明顯變化，損傷7 d 后，損傷血管壁MCPIP蛋白表達水平開始增加(P<0.01)，且隨損傷時間的延長，MCPIP 蛋白表達水平也呈上升趨勢，至損傷后28 d，MCPIP蛋白表達達到最高值(P<0.01，見圖3)。

**：與假手術(shù)組比較，P<0.05；1：假手術(shù)組；2：損傷3 d；3：損傷7 d；4：損傷14 d；5：損傷28 d。圖3 損傷血管MCPIP的蛋白表達

3 討論

PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生是局部血管損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)過程，其作用機制主要包括血管彈性回縮、血管重塑、血栓形成、血小板沉積、以及VSMC過度增殖及遷移等，其中VSMC增殖和遷移能力的增強是再狹窄的主要機制[10]。因此，VSMC的增殖與遷移在PCI術(shù)后再狹窄中占主導(dǎo)地位。本實驗通過建立球囊損傷大鼠頸總動脈內(nèi)膜模型，復(fù)制PCI術(shù)后再狹窄的過程，觀察大鼠頸總動脈內(nèi)膜的損傷情況。病理學(xué)研究結(jié)果表明，球囊損傷血管后，增生的VSMC向內(nèi)膜下遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜不斷增生，且隨損傷時間的延長，內(nèi)膜增生的程度不斷增加。這與文獻報道一致[11]。

本研究通過Real Time-PCR 和Western blot結(jié)果表明，大鼠頸動脈球囊損傷后，隨損傷時間的延長，MCPIP表達水平也不斷增加。高表達的MCPIP對血管內(nèi)膜增生引起再狹窄的發(fā)生和發(fā)展具體發(fā)揮一種什么作用目前尚不清楚。MCPIP是一種具有轉(zhuǎn)錄活性的與心血管疾病、自身免疫以及炎癥相關(guān)的多功能蛋白。羅潔等[12]研究在動脈粥樣化模型中，大鼠主動脈中MCPIP的表達明顯高于正常大鼠；研究還發(fā)現(xiàn)，MCPIP作為一個轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控細胞核內(nèi)c-fos 基因表達，促進VSMC的增殖[13]。因此，在血管內(nèi)膜增生引起再狹窄的進程中表達逐漸增加的 MCPIP 有可能通過發(fā)揮上述功能促進血管再狹窄發(fā)生、發(fā)展。對此問題的深入探索將有助于認識PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生機制及治療控制靶點，也是我們的后續(xù)研究工作。