孟慶峰，張 柳， 楊彩玲，周 璇，付少彬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院食品基礎(chǔ)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

地球生物圈內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)中地衣型真菌與相應(yīng)的藻類或藍(lán)細(xì)菌結(jié)成穩(wěn)定的胞外共生的生態(tài)群落[1]。地衣因其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境，生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生一些獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)，初生代謝產(chǎn)物中地衣多糖往往表現(xiàn)出良好的生物活性，次生代謝產(chǎn)物主要有縮酚酸類及其衍生物、蒽醌、萜類、脂肪酸及甾體類，這些獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)使地衣的食藥用價(jià)值不同于植物[2]，地衣以及地衣共生菌種結(jié)構(gòu)新穎的化合物也報(bào)道的越來(lái)越多[3-4]，地衣具有抑菌、抗輻射、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等方面的作用[5-8]，魏江春曾經(jīng)在《中國(guó)藥用地衣》中收錄71種藥用地衣，結(jié)合民間調(diào)查，楊美霞等人列出了130多種藥用地衣，由此可見(jiàn)，中國(guó)的中醫(yī)、藥學(xué)博大精深、源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[2]。此外，地衣在沙漠治理等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，地衣在土壤或巖石表面的覆蓋可以有效阻止水分的蒸發(fā)，并有利于水分在巖石表面的蓄積，這為苔蘚及種子植物的生長(zhǎng)提供了最基本的條件[9]，這其中地衣的菌絲組織以及其中的多糖等物質(zhì)功不可沒(méi)。地衣多糖是地衣中一類重要的活性成分，石耳地衣多糖具有抗氧化的作用，從一種裸緣梅衣Parmotremamantiqueirense中提取的多糖經(jīng)硫酸化以后具有了比較好的抗血栓、抗凝血的作用，地衣多糖能夠明顯提高免疫抑制小鼠的免疫功能，樹(shù)花多糖有較強(qiáng)的還原力，能有效抑制.OH、O-.[10-12]。

聚篩蕊Cladiaaggregate(Sw.)Ny1隸屬于石蕊科Cladeaceae，篩蕊屬Cladia[13]，以全草入藥，其中只含有巴巴酸，從聚篩蕊地衣中分離出19種化學(xué)成分，主要為烯烴醇、醛、酮和呋喃等含氧揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)，聚篩蕊對(duì)重金屬鎘和汞有富集作用[14]，而聚篩蕊多糖的提取和活性研究少見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)采自貴州都勻斗篷山景區(qū)的聚篩蕊地衣進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，采用熱水浸提法和乙醇沉淀法提取聚篩蕊地衣中的粗提物，通過(guò)苯酚硫酸法計(jì)算粗提物的含量，最后用瓊脂擴(kuò)散法研究粗提物的抑菌性情況，為該地區(qū)聚篩蕊地衣資源開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 分析天平(FA2004N，上海菁海儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；醫(yī)用離心機(jī)(H1650-W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；酶標(biāo)儀(RT6500，BIO-RAD公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS，上海亞榮生化儀器廠)；體視顯微鏡(SMC-745，上海巍途光電技術(shù)有限公司)；超凈工作臺(tái)(VS-1300L-U，蘇凈安泰)；精密鼓風(fēng)干燥箱(BPG-9140A型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 地衣體和菌株 聚篩蕊地衣體采自貴州省都勻市斗篷山景區(qū)的茅草坡，海拔950 m，生長(zhǎng)于土壤表層。實(shí)驗(yàn)菌株保存在本實(shí)驗(yàn)室，見(jiàn)表1。

表1主要菌株

序號(hào)菌種名稱編號(hào)1銅綠假單胞菌ATCC 278532大腸埃希氏菌ATCC 259223金黃色葡萄球菌ATCC 65384鼠傷寒沙門(mén)菌ATCC 140285藤黃微球菌CMCC 280016金黃色葡萄球菌ATCC 259237宋氏志賀菌CMCC 515928白色念珠菌ATCC 102139大腸桿菌ESBL 1302510表面葡萄球菌ATCC 12228

1.3 藥品試劑 實(shí)驗(yàn)中主要的試劑見(jiàn)表2。

表2主要試劑

序號(hào)試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家1無(wú)水乙醇AR成都市科龍化工試劑廠2苯酚AR成都金山化學(xué)試劑有限公司3硫酸AR成都市科龍化工試劑廠4青霉素V鉀片0.239 g(40萬(wàn)單位)通藥制藥集團(tuán)股份有限公司5硫酸慶大霉素顆粒10 mg(1萬(wàn)單位)葵花藥業(yè)集團(tuán)(衡水)得菲爾有限公司6無(wú)水葡萄糖AR成都市科龍化工試劑廠7NaClAR成都市科龍化工世紀(jì)廠8LB培養(yǎng)基250g上海博微生物科技有限公司

1.4 方法

1.4.1 聚篩蕊地衣的形態(tài)學(xué)鑒定 將地衣置于光學(xué)體視顯微鏡下，觀察并記錄地衣體的類型、顏色、粉芽、裂芽、子囊盤(pán)的有無(wú)及形狀、直徑、著生方式、分枝狀況等形態(tài)特征。

1.4.2 聚篩蕊地衣粗多糖的提取 將聚篩蕊地衣用清水浸泡2 min，然后置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎后準(zhǔn)確稱量1 g聚篩蕊地衣樣品于燒杯中并按料液比(地衣體：水)1∶30(m:v)，放于80 ℃恒溫水浴鍋中提取3 h， 4 000 rmp離心5 min后取出上清液，恒溫浸提3次，合并上清液，減壓濃縮后用無(wú)水乙醇沉淀，乙醇終濃度為70%，4 ℃冰箱沉淀24 h后離心得粗多糖，50 ℃干燥稱粗多糖重量。

1.4.3 粗提物含量的測(cè)定 多糖含量測(cè)定選用常規(guī)的苯酚-硫酸法。

1.4.4 聚篩蕊地衣粗多糖抑菌試驗(yàn) 供試菌株的活化和菌懸液制備：將菌株在液體肉湯培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，然后用無(wú)菌水稀釋成105CFU菌懸液，待用。

樣品制備：將粗多糖樣品制備成2.5 mg/mL的溶液。青霉素V鉀和硫酸慶大霉素制備成1 mg/mL溶液作為陽(yáng)性對(duì)照溶液，備用。

抑菌實(shí)驗(yàn)：用無(wú)菌棉簽沾取供試菌菌懸液，在LB培養(yǎng)基固體平板上輕輕涂勻，待表面稍稍干燥后，用6 mm打孔器均勻打3個(gè)孔，吸取少量融化狀態(tài)的無(wú)菌固體培養(yǎng)基，滴于小孔，待冷卻后密封底部。用移液器分別向3孔移取80 μL樣品、陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。37 ℃正置培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的有無(wú)及大小。

2 結(jié)果

2.1 地衣體形態(tài)學(xué)鑒定 地衣體為枝狀，土壤生，直立叢生，顏色主要呈褐綠色或少許褐色，二叉式或不規(guī)則分枝，分枝稠密，無(wú)粉芽和裂芽，中空?qǐng)A柱狀，篩孔直徑在0.5～2 mm，分枝表面光滑有光澤，枝腋間主要呈橢圓形，無(wú)子囊盤(pán)，地衣果柄頂端呈黑褐色，高3.5～7 mm。該地衣為聚篩蕊地衣，顯微鏡下圖片見(jiàn)圖1。

圖1 體視顯微鏡下聚篩蕊形態(tài)

2.2 粗多糖的含量 通過(guò)熱水提取，乙醇沉淀得到的粗多糖為白色略帶黃色的不定性粉末(見(jiàn)圖2)，由公式：提取率=(粗多糖質(zhì)量/聚篩蕊地衣質(zhì)量)×100%，得出粗多糖的提取率為2.14%。通過(guò)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程y=0.691x-0.2064，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948。根據(jù)測(cè)得的吸光度值,計(jì)算得出地衣多糖的粗多糖含量為19.64 mg/g。

圖2 提取的聚篩蕊粗多糖

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聚篩蕊地衣粗多糖對(duì)10株供試菌株均未顯示明顯的抑制活性，部分結(jié)果見(jiàn)圖3，除了陽(yáng)性對(duì)照藥，瓊脂平板培養(yǎng)基中沒(méi)有抑菌圈，說(shuō)明聚篩蕊粗多糖對(duì)所提供的供試菌沒(méi)有抑菌效果。

圖3 粗多糖抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

地衣作為第一個(gè)登陸的先鋒生物，在長(zhǎng)期不斷進(jìn)化過(guò)程中，擁有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，尤其是抗逆能力，極冷、極熱、極干燥、強(qiáng)紫外線等件下均能保持旺盛的生長(zhǎng)，這些逆性環(huán)境造就了地衣體內(nèi)成分的復(fù)雜性和功能的多樣性，本研究以聚篩蕊粗提物做抗菌活性研究，以期篩選抗臨床致病菌和耐藥菌的活性多糖，結(jié)果顯示聚篩蕊對(duì)篩選的致病菌未顯示出抗菌活性，可能與其化學(xué)成分較為單一有關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道其地衣成分中以巴巴酸為主[13]。聚篩蕊地衣多糖雖然在抗菌方面未顯示出明顯效果，但地衣多糖在調(diào)節(jié)免疫功能方面也很有優(yōu)勢(shì)[15]，冰島衣中的β-1,3/1,4-葡聚糖能夠誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞分化[16]。聚篩蕊地衣多糖可能也會(huì)表現(xiàn)出其他方面的活性，如抗氧化、抗癌等，在后續(xù)研究中我們也會(huì)開(kāi)展地衣多糖更廣泛的活性研究。由于聚篩蕊在斗篷山地區(qū)有較為明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，在眾多地衣種類中，屬于數(shù)量較多的一個(gè)類群，開(kāi)展其成分的活性篩選研究可以為地衣資源的開(kāi)發(fā)及利用提供參考，具有深遠(yuǎn)的意義。