鄧 艷，尹彩霞，高健美，龔其海

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由缺血性、出血性、急慢性缺氧性腦血管病等因素導(dǎo)致腦組織損害引起的以認知功能減退為特征的一組臨床綜合征，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型，約占所有癡呆的17%～20%[1]。目前，臨床上治療VD的方法主要有：①預(yù)防性治療原發(fā)性腦血管病；②治療腦功能障礙；③改善腦組織代謝[2]。但這些藥物只能控制部分癥狀，療效有限，原因可能與其作用靶點單一，無法對腦缺血后復(fù)雜的病理生理反應(yīng)提供全面、有效的保護有關(guān)。因此，探索VD的發(fā)病機制，尋求有效的治療方法迫在眉睫。

目前，關(guān)于VD的危險因素及確切的發(fā)病機制尚不清楚。有研究報道，慢性腦低灌注(chronic cerebral hypopermsin,CCH)是認知功能減退和血管性癡呆發(fā)生的關(guān)鍵原因[3]。CCH可導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少、血腦屏障破壞、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)等，進而引起神經(jīng)元功能損傷、軸突破壞、突觸丟失等一系列病理變化，最終使患者出現(xiàn)不同程度的記憶功能障礙[4]。因此，研發(fā)防治CCH的藥物意義重大。

淫羊藿是我國傳統(tǒng)中草藥，屬小檗科淫羊藿屬(EpimediumL)植物，具有“補腎陽，強筋骨，祛風濕，益氣力，強志”等功效[5]。淫羊藿次苷II(Icariside II,ICS II)是淫羊藿的黃酮類活性成分之一[6]，具有多重生物學和藥理學活性，包括抗炎、抗氧化、抗衰老、抗勃起性功能障礙和抗癌等[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICS II可明顯減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模式小鼠、β-淀粉樣蛋白25-35或鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠學習記憶減退，其機制均與ICS II降低磷酸二酯酶5(Phosphodiesterase,PDE 5)含量有關(guān)[8-10]。此外，ICS II還可改善雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)誘導(dǎo)的CCH大鼠學習記憶減退[11]，但其機制尚不清楚。因此，本研究采用BCCAO建立CCH模型，探究ICS II改善CCH大鼠學習記憶減退的機制，為研發(fā)治療VD的藥物提供藥理學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 Multiskan Go 酶標儀(美國Thermo公司)；蛋白變性儀、逆轉(zhuǎn)錄儀、臺式離心機(德國Eppendorf公司)；DDY-10型三恒電泳儀、半干轉(zhuǎn)印槽、全自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)； ICS II(批號：MH150601S02，經(jīng)HPLC檢測其純度≥98%)購于中國南京澤朗生物科技有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)一抗(批號：ab92486)(美國Abcam)；Smad2一抗(批號：#5339)、Phospho-Smad2(p-Smad2)一抗(批號：#18338)(美國Cell Signaling Technology)；β-肌動蛋白(β-actin)一抗(中國碧云天)；PDE 4、PDE 5試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度含量測定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、山羊抗兔免疫球蛋白G(辣根過氧化物酶標記)、山羊抗小鼠免疫球蛋白G(辣根過氧化物酶標記)、5×上樣緩沖液、ECL發(fā)光劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實驗動物與分組 3月齡，SPF級，健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只(購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心(重慶)，許可證號：SCXK2012-0011，體重為250±20 g)，通過簡單隨機抽樣法分為：假手術(shù)組(sham)、假手術(shù)+ICS II高劑量組(sham + ICS II 16 mg/kg)、模型組(BCCAO)、ICS II低劑量組(BCCAO + ICS II 4 mg/kg)、ICS II中劑量組(BCCAO + ICS II 8 mg/kg)、ICS II高劑量組(BCCAO + ICS II 16 mg/kg)，每組樣本含量為6只。

1.3 慢性腦低灌注模型建立 大鼠稱重，2%戊巴比妥鈉溶液(麻醉劑量為50 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，剔除頸部毛發(fā)，仰臥位固定于鼠板上，用碘伏對頸部進行消毒處理，然后正中切開頸前皮膚，用玻璃分針分離出雙側(cè)頸總動脈，然后分別用5-0醫(yī)用非吸收線結(jié)扎，最后縫合傷口，并涂抹紅霉素軟膏(防止傷口發(fā)炎)，慢性腦低灌注模型制備完成。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，其余操作與模型動物相同。造模10 d后給藥，ICS II低、中、高劑量組每日分別灌胃ICS II 4、8、16 mg/kg，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)給藥28 d。第29天，將各組大鼠麻醉處死，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬組織，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗 取各組大鼠海馬組織，加入500 μL預(yù)冷0.01 mmol/μL PBS(pH 7.2～7.4)溶液，用研磨棒搗碎腦組織，冰上靜置30 min，956×g、4℃、離心20 min，取上清液，分裝后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；采用BCA法測定蛋白濃度；然后，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒說明書具體步驟操作，分別檢測PDE4、PDE5的含量。

1.5 Western blot實驗 取各組大鼠海馬組織，加入RIPA裂解液，用研磨棒搗碎，冰上靜置30 min后，956×g、4℃、離心15 min，取上清液，分裝后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫徊捎肂CA法測定蛋白濃度；每個樣本以30 μg的上樣量進行電泳，待蛋白完全分離，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，然后用5%脫脂牛奶封閉2 h，再洗3次后分別用TGF-β1(1∶1 000)，Smad2(1∶1 000)，p-Smad2(1∶1 000)，β-actin(1∶5 000)一抗孵育過夜，次日取出，TBST緩沖液洗膜3次，然后用山羊抗兔IgG(HRP標記)、山羊抗小鼠IgG(HRP標記)的二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h，洗膜3次，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯影，并使用Quantity One-4.6.7進行量化。

2 結(jié)果

2.1 ICS II對BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬中PDE 4、PDE 5蛋白含量的影響 通過ELISA法測定海馬PDE 4和PDE 5蛋白含量的研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬中PDE 4和PDE 5蛋白表達顯著增加。然而，連續(xù)灌胃ICS II 8 mg/kg和16 mg/kg 28 d顯著抑制了BCCAO誘導(dǎo)的大鼠海馬中PDE 4和PDE 5蛋白表達的增加，但是ICS II 4 mg/kg無差異[F(5,29)= 164.5,P<0.001;F(5,30)= 21.1，P<0.001](P<0.01;P<0.01;P<0.05;P<0.01,見圖1)。

A：海馬PDE 4蛋白表達的定量分析；B：海馬PDE 5蛋白水平的定量分析；n=5～6；**：與Sham組相比，P<0.01；#：與BCCAO組相比，P<0.05；##：與BCCAO組相比，P<0.01。圖1 ICS II抑制BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬PDE 4和PDE 5蛋白水平

2.2 ICS II對BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬中的TGF-β1蛋白的影響 通過Western blot測定海馬TGF-β1蛋白表達的研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，BCCAO組大鼠海馬中TGF-β1蛋白表達顯著增加(P<0.01)；連續(xù)灌胃ICS II 8 mg/kg和16 mg/kg 28 d顯著降低BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬中TGF-β1蛋白表達(P<0.05;P<0.01)，但是ICS II 4 mg/kg無差異[F(5,12)=13.4，P=0.001](P>0.05)(見圖2)。

2.3 ICS II對BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬中Smad2磷酸化的影響 通過Western blot測定海馬Smad2、p-Smad2蛋白表達，結(jié)果顯示，與Sham組比較，BCCAO組大鼠海馬中Smad2蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；連續(xù)灌胃ICS II 8 mg/kg和16 mg/kg 28 d顯著降低了BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬中Smad2蛋白磷酸化水平(P<0.01;P<0.01)，但是ICS II 4 mg/kg無差異[F(5,12)= 9.1,P= 0.001](P>0.05)(見圖3)。

A：海馬TGF-β1蛋白電泳條帶；B：海馬TGF-β1蛋白的定量分析；n=3；**：與Sham組相比，P<0.01；#：與BCCAO組相比，P<0.05；##：與BCCAO組相比，P<0.01。 圖2 ICS II抑制BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬TGF-β1蛋白表達

A：海馬Smad2、p-Smad2蛋白電泳條帶；B：海馬p-Smad2蛋白的定量分析；(n=3)；**：與Sham組相比，P<0.01；##：與BCCAO組相比，P<0.01。 圖3 ICS II抑制BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠海馬Smad2蛋白磷酸化

3 討論

CCH在VD的進行性認知功能障礙中起關(guān)鍵作用。BCCAO大鼠慢性期的神經(jīng)病理改變與人類阿爾茨海默病和老齡化時CCH相似[12]，因此，被廣泛用于研究CCH對認知功能損害以及神經(jīng)變性疾病的影響。本課題組前期采用BCCAO誘導(dǎo)CCH模型來研究ICS II對大鼠認知功能的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCCAO可以誘導(dǎo)大鼠的空間學習和記憶障礙以及神經(jīng)元損傷，而ICS II可劑量依賴性地改善BCCAO導(dǎo)致的大鼠學習記憶功能減退[11]。但是，其作用機制尚不明確，因此，本研究進一步探索了ICS II改善CCH大鼠學習記憶減退的作用機制。

PDE 4和PDE 5分別是環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)特異性水解酶[13]。靶向抑制PDE 4和PDE 5以增強認知功能已涉及阿爾茨海默病的治療[14]。有趣的是，我們前期研究發(fā)現(xiàn)ICS II是一種新型PDE 5抑制劑，可有效減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞死亡并改善AD大鼠模型的認知功能障礙[15-17]。本研究結(jié)果表明BCCAO大鼠海馬中PDE 4和PDE 5的蛋白表達都顯著增加，表明PDE 4和PDE 5都可能參與VD的發(fā)病機制，而ICS II 8、16 mg/kg可明顯抑制BCCAO誘導(dǎo)的PDE 4和PDE 5水平的增加。但是，ICS II 4 mg/kg沒有差異，可能是因為此劑量還未達到有效劑量。值得注意的是，ICS II對PDE 5的抑制作用高于對PDE 4的抑制作用，與前期研究結(jié)果一致[16]。

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad信號通路也參與VD的發(fā)病機制[18]。TGF-β1是一種多效細胞因子，主要在星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和海馬神經(jīng)元中表達，以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞分化、小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)元存活[19-20]，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于受體后的信使分子Smad來完成。來自TGF-β的信號與細胞膜表面Ⅰ型、Ⅱ型受體結(jié)合后使R-Smad(Smad2、Smad 3)磷酸化而活化，Smad2和Smad3與胞質(zhì)中的Co-Smad結(jié)合形成異聚體轉(zhuǎn)位進入細胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達[21]。有研究報道，VD患者腦脊液中TGF-β的含量呈顯著升高趨勢[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCH大鼠海馬中TGF-β1蛋白表達增加而且Smad2磷酸化水平升高。ICS II 8、16 mg/kg明顯降低TGF-β1蛋白表達以及Smad2磷酸化水平。但是，ICS II 4 mg/kg沒有差異，可能是因為此劑量還未達到有效劑量。

綜上所述，在本實驗條件下，ICS II改善BCCAO誘導(dǎo)的CCH大鼠認知功能障礙可能與其降低PDE 4和PDE 5蛋白表達，阻斷TGF-β1/Smad2信號傳導(dǎo)有關(guān)。為ICS II作為PDE 5的抑制劑治療CCH所致癡呆(如VD)提供了藥理學依據(jù)。