魏謀達(dá)，張 寧，邢澤峰，尹曉偉，李志斌，段銀鐘

(1.南京牙博士口腔醫(yī)院，江蘇 南京 210005；2.空軍軍醫(yī)大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710032)

牙周膜成纖維細(xì)胞是常見的牙周膜細(xì)胞(Periodontal ligament,PDLC)，其死亡方式主要有3種：細(xì)胞自噬、細(xì)胞壞死以及細(xì)胞凋亡[1]。H2O2是口腔臨床治療藥物，不僅具有治療作用，還可誘發(fā)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞凋亡。因此，研究H2O2誘導(dǎo)凋亡機(jī)制非常重要，這樣才能有效地防止細(xì)胞非正常死亡。

連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中最強(qiáng)的內(nèi)源性抑制因子，可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白酶的表達(dá)產(chǎn)生抗凋亡作用[2]。XIAP 的抑制活性在于氨基端的BIRD(baculovirus IAP repeats domain,BIRD)功能域及其之間的連接區(qū)域，以及羧基端的環(huán)狀鋅指結(jié)構(gòu)[3]。有研究表明，XIAP能直接結(jié)合并抑制caspase-3、7、9[4-5]。XIAP除抑制caspase 外，還受多種因子的調(diào)節(jié)。有研究表明，Akt在體外或體內(nèi)都可以作用于XIAP；另外，XIAP的自我泛素化也被Akt 抑制。因此可認(rèn)為XIAP 是Akt的下游靶標(biāo),是Akt效應(yīng)通路主要介質(zhì)[6]。c-Jun N-terminal kinase (JNK)，glycogen synthase kinase-3β(GSK3β)以及 protein kinase B (Akt) 3種激酶在細(xì)胞凋亡中均起重要作用。但前兩者與XIAP的關(guān)系目前尚不清楚。

因此，在本研究中我們探討XIAP在H2O2誘導(dǎo)PDLC凋亡中的作用，研究XIAP與 Akt、JNK2以及GSK3β之間的關(guān)系，為牙周驗證的預(yù)防和治療及組織的修復(fù)重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force，德國)；Asinvert 200倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；超凈化工作臺(Thermo Forma，美國)；高速低溫離心機(jī)(Backman，美國)；流式細(xì)胞儀(BD，美國)；酶標(biāo)儀、恒壓電泳儀、Western-blot 轉(zhuǎn)印儀、微量蛋白轉(zhuǎn)移印跡分析儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 試劑 宿主菌 DH5α為本實驗室保存。質(zhì)粒載體pWPI和pLVTHM(Addgene美國)；高保真 PrimeSTAR?HS DNAPolymerase、DL2000 marker、T4DNA 連接酶、dNTP 及XbaI等各種限制性內(nèi)切酶(TaKaRa，日本)；PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取及純化試劑盒(上海生工，中國)；PRIM-1640、高糖DMEM、胎牛血清(GIBCO，美國)；高效真核轉(zhuǎn)染試劑(JetPei polyplus，法國)；Anti-XIAP抗體(BD，美國)；Anti-GAPDH、Anti-β-actin、Anti-PTEN、Anti-JNK2、Anti-Akt、Anti-pAkt、FITC-Goat Anti-Mouse 一抗、FITC-Goat Anti-Mouse 二抗(Sigma，美國)；Anti-GSK3β(abnova，中國臺灣)；c-jun、AP-1(Abcam，美國)；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠二抗、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗(康為世紀(jì)，中國)；SDS-PAGE試劑盒(碧云天，國產(chǎn))；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Forma，美國)；Annexiv/PI 凋亡檢測試劑盒(BD，美國)。

1.3 方法

1.3.1 PDLCs的原代培養(yǎng) 將新拔除的離體牙放入預(yù)冷的含100 U/mL青霉素和100 U/mL 鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，送至實驗室培養(yǎng)。本實驗經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會審批。原代培養(yǎng)方法根據(jù)文獻(xiàn)采用組織塊-酶消化聯(lián)合培養(yǎng)技術(shù)[7]，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長、形態(tài)及排列情況并照相記錄。

1.3.2 Western blot檢測XIAP、Caspase-3、Caspase-8、PTEN的表達(dá) 未經(jīng) H2O2處理的PDLC細(xì)胞作為對照組。PDLC經(jīng)125或250 μM H2O2處理48、72 h后，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上放置15～30 min，細(xì)胞充分裂解12 000 rpm離心。電壓濃縮膠60 V，分離膠80 V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜。NC膜用1%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入XIAP、Caspase-3、Caspase-8、PTEN(均為1∶1 000)等一抗，4 ℃過夜，次日加入二抗，室溫下振搖1～1.5 h。加入底物顯色液，室溫避光顯色，膠片曝光采集圖像。

1.3.3 XIAP基因過表達(dá)和沉默PDLC細(xì)胞株的建立 以感染倍數(shù)(multiplicity of infection,MOI)100 進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染。感染前細(xì)胞生長24 h，吸出培養(yǎng)基，用無血清無抗生素α-MEM洗滌 2 次；確定所需病毒顆粒量(=細(xì)胞數(shù)×MOI)，用無血清無抗生素α-MEM稀釋病毒液，盡量減少α-MEM體積，能覆蓋細(xì)胞表面即可；輕輕傾斜和搖晃培養(yǎng)器皿，使病毒液均勻分布，置于37 ℃孵箱中孵育2 h，每隔15 min輕輕傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)器皿，促進(jìn)感染；2 h后，補(bǔ)加適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育22 h(共感染24 h)；更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育。過表達(dá)和基因沉默后，以PDLC細(xì)胞作為對照組，Western blot檢測 XIAP 蛋白的表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效果。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率達(dá) 80%。

1.3.4 過表達(dá)及沉默XIAP后，流式細(xì)胞儀器檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染XIAP 48 h后加入250 μM H2O2作用72 h，胰酶消化，1 000 rpm離心5 min，去除上清液，預(yù)冷PBS清洗2次。加 400 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加入Annexin-V-FITC 5 μL，放置于4℃冰箱中避光孵育15 min。加入碘化丙錠(PI)10 μL，避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5 過表達(dá)及沉默XIAP后對Akt、p-Akt、JNK2、GSK3β表達(dá)的影響 培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入濃度為 250 μM的H2O2在 37 ℃5 % CO2及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.3.6 過表達(dá)XIAP后免疫熒光檢測Akt、p-Akt 濃度為 1x106/mL 的細(xì)胞懸液，接種到在鋪有蓋玻片的 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，至 60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 DNA，培養(yǎng)24 h后用250 μM的H2O2刺激，然后培養(yǎng)48 h。PBS 洗1次，4%多聚甲醛固定20～30 min。加入50 mM NH4Cl，放置10 min。0.1%～0.2% Triton-100 透化4 min。5%BSA 封閉20～30 min。分別加入Akt(1∶200)、p-Akt(1∶400) (0.5%BSA 稀釋)，室溫孵育2 h。加二抗(0.5%BSA 稀釋)，室溫避光孵育 60 min。滴一滴封片液于載玻片上。指甲油封住蓋玻片四周，避光置于 4℃或免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡測定c-jun、Ap-1在細(xì)胞中的定位和表達(dá) 濃度為1×106/mL 的細(xì)胞懸液，接種到在鋪有蓋玻片的 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，至60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 DNA，培養(yǎng)24 h后用250 μM的H2O2刺激，然后培養(yǎng)48 h。PBS 洗1次，4%多聚甲醛固定20～30 min。加入50 mM NH4Cl，放置10 min。0.1%～0.2% Triton-100 透化4 min。5%BSA 封閉20～30 min。分加入c-jun、Ap-1(均為1∶400，0.5%BSA 稀釋)，室溫孵育2 h。加二抗(0.5%BSA 稀釋)，室溫避光孵育 60 min。滴一滴封片液于載玻片上。指甲油封住蓋玻片4周，避光置于 4℃或激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜細(xì)胞形態(tài)和鑒別 多數(shù)細(xì)胞具有 2 到 3 個細(xì)胞核，細(xì)胞排列較為規(guī)律，呈束狀，或者漩渦狀并表現(xiàn)為放射性狀態(tài)(見圖1A)。對傳代后的第 3代細(xì)胞進(jìn)行 HE 染色，細(xì)胞多呈現(xiàn)出多角形，細(xì)胞質(zhì)能夠被伊紅染色，細(xì)胞核則嗜堿性，多數(shù)為規(guī)則的圓形或者橢圓，處于細(xì)胞的中心位置(圖1B)。免疫組化結(jié)果表明抗波形蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性染色，堿性磷酸酶染色陽性(見圖1C-E)，符合牙周膜細(xì)胞的生物特性。

圖1 牙周膜細(xì)胞形態(tài)及鑒定

2.2 H2O2對XIAP、Caspase-3、Caspase-8、PTEN表達(dá)的影響 250 μM H2O2刺激PDLC細(xì)胞72 h后， XIAP蛋白表達(dá)量顯著下調(diào) (P<0.05)(見圖2A)。 Caspase-3、Caspase-8和PTEN蛋白表達(dá)隨H2O2濃度及作用時間增加逐漸增加，具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(見圖2B)。

A：XIAP蛋白的表達(dá)；B：Caspase-3、Caspase-8和PTEN蛋白的表達(dá)；與24h-0比較*：P<0.05，**：P<0.01。 圖2 不同劑量H2O2處理后，XIAP、Casepase-3、Casepase-8及PTEN的表達(dá)

2.3 過表達(dá)及沉默對XIAP表達(dá)的影響 過表達(dá)組XIAP蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而沉默組XIAP蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(見圖3)，表明過表達(dá)和沉默載體構(gòu)建成功。

圖3 過表達(dá)和沉默XIAP對XIAP蛋白的影響

2.4 過表達(dá)及沉默對H2O2誘導(dǎo)PDLC凋亡的影響 采用PI-FITC雙染檢測細(xì)胞凋亡(見圖4)。Control為對照組，細(xì)胞凋亡率為2.48%；250為250 μM H2O2作用PDLC細(xì)胞72 h，細(xì)胞凋亡率為22.05%；XIAP為250 μM H2O2作用過表達(dá)XIAP細(xì)胞組72 h，細(xì)胞凋亡率為8.05%，相比250細(xì)胞存活率增加。沉默XIAP后，細(xì)胞凋亡率為27.91%。

圖4 過表達(dá)及沉默XIAP對細(xì)胞凋亡的影響

2.5 過表達(dá)及沉默XIAP對Akt、p-Akt、JNK2、GSK3β表達(dá)的影響 過表達(dá)XIAP后，250 μM H2O2作用72 h，與給予PDLC細(xì)胞250μM H2O2作用72 h后比較(250)，Akt、p-Akt、JNK2和GSK3β蛋白表達(dá)有所恢復(fù)甚至超過對照組，Akt、JNK2和GSK3β為極顯著差異(P<0.001)，p-Akt為顯著性差異(P<0.05)。但沉默XIAP后，與對照組(control)比較，Akt、JNK2和GSK3β蛋白表達(dá)均顯著下降，Akt、p-Akt、JNK2為極顯著差異(P<0.001)，GSK3β為顯著性差異(P<0.05)。

*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。 圖5 過表達(dá)和沉默XIAP對 AKT、p-Akt、JNK2及GSK3β表達(dá)的影響

2.6 免疫熒光檢測過表達(dá) XIAP對Akt及p-Akt的影響 經(jīng)250 μM H2O2處理72 h后，與對照組比較，紅色和綠色熒光變?nèi)酰仙珶晒庾兓淮?，說明H2O2處理組細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt和GFP蛋白均有所減少。與對照組相比，XIAP過表達(dá)組Akt、p-Akt和GFP蛋白表達(dá)均增加。說明正常狀態(tài)下，XIAP可能和Akt及p-Akt相互作用(見圖6)。

2.7 激光共聚焦顯微鏡檢測過表達(dá) XIAP對c-jun、Ap-1的影響 與對照組比較，過表達(dá)XIAP組熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，說明c-jun及AP-1蛋白表達(dá)增加(見圖7)。

圖6 免疫熒光檢測AKT，p-Akt(400×)

圖7 過表達(dá) XIAP對GSK3β信號通路的影響

3 討論

50μM H2O2作用48 h后，XIAP蛋白表達(dá)無顯著性變化(P>0.05)，作用72 h后，XIAP蛋白顯著降低(P<0.05)；隨著H2O2濃度和作用時間增加，XIAP 蛋白的表達(dá)受到抑制，Caspase-3、Caspase-8和PTEN顯著增加促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。說明 XIAP 蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡成負(fù)相關(guān)，與Takahashi等[9]的結(jié)論一致。

本研究中，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默和過表達(dá)XIAP對細(xì)胞凋亡的影響。與對照組比較，250μM H2O2作用正常細(xì)胞組72 h后凋亡率顯著上升；過表達(dá)XIAP給予250μM H2O2作用72 h后，細(xì)胞凋亡率顯著下降。此外，沉默XIAP后，細(xì)胞凋亡率顯著上升。有研究表明，目前已證明 XIAP 在人體的多種組織中表達(dá)，在正常組織中低水平表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯升高[10-11]。說明過表達(dá) XIAP能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗逆作用，同時引導(dǎo)細(xì)胞的無限增殖；沉默XIAP后，某些癌癥細(xì)胞的死亡受體或者細(xì)胞毒性藥物能夠很好的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，說明XIAP蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡具有非常重要的意義。

有關(guān)XIAP抗凋亡的機(jī)理的研究較少，尚沒有XIAP蛋白的相關(guān)報道，另外，XIAP在氧化損傷所致細(xì)胞凋亡中的作用以及其與Akt/JNK/AP-1細(xì)胞通路間的關(guān)系并不明確。本研究中，我們通過Western blot檢測過表達(dá)和沉默XIAP對Akt及p-Akt的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)XIAP能夠?qū)KT的表達(dá)起到極顯著性的修復(fù)作用(P<0.001)，同時也能對p-Akt的表達(dá)進(jìn)行恢復(fù)，并超過自然狀態(tài)下內(nèi)源性p-Akt的量，以上結(jié)果表明，適當(dāng)調(diào)控XIAP和p-Akt蛋白，也許可以逆轉(zhuǎn)Akt誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

XIAP是JNK信號通路一個重要的抑制蛋白，有實驗表明TGF 處理后，XIAP基因產(chǎn)物上調(diào)，同時導(dǎo)致JNK信號通路關(guān)閉[13]。本研究中，過表達(dá)XIAP后，250μM H2O2作用72 h，與給予PDLC細(xì)胞250μM H2O2作用72 h后比較(250)，JNK2的表達(dá)顯著增加(P<0.05);沉默XIAP后，與對照組比較，JNK2蛋白表達(dá)顯著下降。此外，激光共聚焦顯微鏡證實過表達(dá)XIAP后，細(xì)胞中的C-jun以及AP-1和AKT蛋白的表達(dá)均增加。該結(jié)果說明XIAP能夠調(diào)節(jié)并控制JNK2蛋白表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡。

在后續(xù)的研究中，我們可以將XIAP在保護(hù)細(xì)胞遭受如H2O2等強(qiáng)氧化劑作用的與其他蛋白的耦合作為一個突破口，這樣就可能找到XIAP是通過哪些通路分別與JNK，GSK以及Akt信號通路共同調(diào)控細(xì)胞的存活，這將會是我們對牙周再生領(lǐng)域的一次積極探索。